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1、实验7质粒的酶切、琼脂糖凝胶电泳分离DNA,实验目的 实验原理 实验仪器、材料与试剂 实验步骤 实验结果及讨论,实验目的,限制性内切酶切割出目的DNA了解琼脂糖凝胶电泳的原理掌握琼脂糖凝胶的制作及进行电泳的方法,实验原理,利用限制性内切酶具有特定的识别及切割位点，定点切割环状质粒DNA。琼脂糖凝胶电泳是基因工程操作中常规的实验方法，它能检测少量的DNA（如用肉眼观察，可检测到10 ng的DNA），且检测的范围很广。,影响核酸限制性内切酶活性的因素(1)DNA的纯度；(2)DNA的甲基化程度；(3)酶切消化反应的温度；(4)DNA的分子结构；(5)溶液中离子浓度及种类；(6)缓冲液的 pH值。,
2、琼脂糖凝胶电泳的原理是溴化乙锭在紫外光照射下能发射荧光，当DNA样品在琼脂糖凝胶中从负极向正极泳动时，溴化乙锭从正极向负极移动，这样溴化乙锭分子就会嵌入DNA分子中形成络合物，使DNA在紫外光下发射很强的荧光。在溴化乙锭足够的情况下，荧光的强度正比于DNA的含量，这样就可以检测DNA的浓度。,实验仪器、材料与试剂,（一）仪器 1.水平式凝胶电泳槽 2.稳压电泳仪 3.电炉 4.紫外检测仪 5.台式离心机,（二）材料 实验一中提取的质粒DNA和酶切后的质粒DNA。,（三）试剂 1.限制性内切酶 2.TAE电泳缓冲液(50)（pH8.0）Tris 242g 冰醋酸 57.1ml 0.5mol/L
3、EDTA（pH8.0）100ml 3.溴化乙锭溶液 10mg/ml水溶液，室温，棕色瓶或铝铂纸包装保存。4.10DNA样品上样缓冲液 5.琼脂糖,实验步骤,酶切体系配制酶切体系如下:(共 20L)质粒 16 L 10X Buffer K 2 L BamH I 1 L Pst I 1 L 轻甩并混匀后（再轻甩去除气泡）放于37水浴，酶切1.5小时。,琼脂糖凝胶制备,1.洗净电泳槽、制胶槽、梳子、挡板，晾干。2.插好挡板、梳子。3.根据实验所需称取0.5克琼脂糖，放入制胶 的容器中（一般用三角瓶），然后加入50ml电泳缓冲液（1TAE）。4.加热煮沸，使琼脂糖完全溶解。5.溶液冷至约60时，加入溴
4、化乙锭5 L(终浓度为0.1 g/l)，轻轻摇匀，倒入制胶槽上，检查有无气泡。,6.室温下约30-45分钟后，琼脂糖溶液完全凝固，小心垂直拔出梳子和挡板，清除碎胶，将凝胶放入电泳槽中。7.加入电泳缓冲液（1TAE）至电泳槽中，使液面高于胶面约1mm。8.在DNA样品中加入2 L(1/10体积)的10 DNA上样缓冲液(loading buffer)，混匀，稍甩一下，使溶液都处于离心管底。9.用移液器吸起离心管中溶液，移入凝胶的梳孔中。,10.插上导线，打开电泳仪电源，按照需要调节电压至120V，电泳开始，观察电流情况或电泳槽中负极的铂金丝是否有气泡出现。11.等溴酚蓝泳动至凝胶前沿后，将电压（
5、或电流）回零，关闭电源，停止电泳。12.取出凝胶，在紫外观测仪上观察电泳结果。13.根据需要切下DNA条带，放入1.5ml Ep管中，放于4保存，以备下周实验用。,实验结果及讨论,对于未进行酶切的质粒来说，常会出现两条电泳带，一条是（松弛）螺旋状质粒DNA带，另一条是超螺旋状质粒DNA的带，以超螺旋状质粒DNA居多，移动速度也最快。有时还会出现三条带，其中一条是因为有一些质粒DNA在提取过程中遭到损伤而线性化，其移动速度介于螺旋状和超螺旋状质粒DNA之间，所以该条电泳带也位于上述两种带之间。如果提取的质粒很好时，这条带会很弱，有时看不到。,Relaxed circle,Linearized form,Super-coiled form,使用3 mg的DNA Marker DL2,000（500 ng/条带）进行1%的琼脂糖凝胶电泳后，各DNA条带自上至下分别为2kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。,
