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1、1,第二节 基因治疗（Gene theraphy）,基因治疗（gene theraphy）：是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病以达到治疗的目的。为达到这一目的，实施相应的策略。,2,1、直接疗法：纠正突变基因 也就是在原位修复缺陷的基因，以达到治疗目的。这种方法上较理想的基因治疗策略，由于存在某些问题，目前正在努力之中。（未实现）2、间接疗法：以正常基因替代致病基因。导入外源正常基因，代替有缺陷的基因。对靶细胞而言，没有去除或修复有缺陷的基因。二者均是用DNA重组技术设法修复患者细胞中有缺陷的基因，使细胞恢复正常功能而达到治疗遗传病的目的。,3,途 径,就基因
2、转移的受体细胞不同，基因治疗有两种途径：1、生殖细胞基因治疗 2、体细胞基因治疗,4,1、生殖细胞基因治疗,理论上将正常细胞基因转移到患者的生殖细胞（精细胞，卵细胞早期胚胎）使其发育成正常个体。这是理想的治疗方法，从根本上治疗遗传病，使其有害基因不能在人群中播散。,5,但还存在某些问题：,1）靶细胞的遗传修饰至今尚无实质性进展；2）基因转移效率不高，只能用显微注射方法；3）只适用于排卵周期短而次数多的动物，很难适用于人类。（但目前辅助生殖技术的发展较为有效的解决了获取卵细胞的办法。一次可获取少者3-5个，多者十几个。）,6,2体细胞基因治疗（somatic cell gene therapy）
3、,是指将正常基因转移到体细胞，使之表达基因产物，以达到治疗的目的。但有害基因能遗传给后代。,7,措 施：,（1）正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。（2）正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。（3）随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。（4）体细胞基因理论不必矫正所有的体细胞。,8,存在的问题：,（1）对特定座位基因转移，目前还存在较大困难；（2）随机插入可能引起后代的基因突变。,9,基因治疗的方法（The methods of gene therapy）,实施基因治疗的第一个关键性步骤是 基因转移 一、Gene转移方
4、法,10,1、正常基因的分离与克隆,基因治疗首先获得目的基因通常从基因组中分离 经克隆 定 位 表 达 评价表达情况,11,2、外源基因的转移,通过不同方法，将目的基因转移至受体细胞。,12,（1）化学法,磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，易通过细胞膜进入细胞内，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。方法简单，但转化效率低。Ca2(PO4)2+DNA 混合微细颗粒（Ca离子浓度 125 mmol，DNA 离子浓度 50ug/ml。PH 7.0）沉淀反应2030min 细胞在沉淀物中暴露 524h,13,(2)物理方法,1、电穿孔法（electropo
5、rotion）将细胞至于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的DNA可渗进细胞，进而表达。瞬间细胞 细胞膜核摸通透性增加 高压脉冲 DNA渗入细胞,14,2、显微注射法（microinjection）,利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核中。,15,例：转基因动物的制备,重组基因 DNA 微注射（体外）小鼠受精卵 回植 假妊娠 仔 鼠 动物模型：转基因鼠(每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传),16,17,clone sheep Dolly体细胞 提取 核 重组细胞 回植 Dolly卵细胞 去核 细胞,18,3、脂质体法（liposome）,应用人工制备的
6、类似细胞膜的膜性结构 脂质体，包装外源基因，再与靶细胞融合，外源DNA导入靶细胞，使其表达。DNA 胞融合 转化细胞 PEG 仙苔病毒,DNA,脂膜,19,4同源重组法,同源重组（homologus recombination）:外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重组而插入染色体。是将外源基因定位导入细胞的染色体上。单交换 双交换,20,通过同源重组定点插入珠蛋白基因,Xha I,BstXI,Xha I,neo,XhaI,BstXI,neo,正常基因座位,带有珠蛋白基因的质粒,重组质粒,C,重组后，插入外源基因外源基因片段带有neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养
7、基中生长，没有插入新基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。,21,5.病毒介导基因内转移（Viral mediated transfer）,是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染受体细胞。图：,感染细胞,重组病毒,22,逆转录病毒(RNA)常用的病毒载体 DNA病毒 1)逆转录病毒（retrovirus）目前应用最多的最成功的是逆转录病毒，病毒感染细胞后，其基因组RNA 经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主染色体形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。完整的病毒颗粒具有插入宿主染色
8、体必需的全套酶系统，适用于介导基因转移。,23,24,例如：小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构：,LTR LTR gag pol envU5 R U3 U5 R U3 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始位点。=病毒包装信号，gag=核心抗原，pol=逆转录酶，env=外壳蛋白。,25,逆转录病毒载体优点：,高效感染宿主细胞，转染率可达100%；病毒基因和所载的外源基因都可能表达；宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留,26,缺 点,病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段；病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的
9、外源基因可能不适当的表达；逆转录病毒有致病作用，可能使受体细胞癌变。根据逆转录病毒的缺点，人们有目的地将其改造，保留其优点，除去癌基因和病毒基因，保留LTR和包装信号。,27,二、靶细胞的选择,是指接受外源Gene的体细胞，选择靶细胞的原则是：1）必须较坚固，便于体外培养和进行遗传技术操作；2）易于由人体分离又便于输回体内，具有增殖优势，生命周期长，能存活几月至几年，或整个生命周期；3）易于受外源遗传物质转化。,28,某些代表性细胞,外周血T淋巴细胞、皮肤成纤维细胞较符合上述要求。此外，造血干细胞地中海贫血、严重复合免疫缺陷病等基因治疗。肝C家族性高胆固醇血症、低密度脂蛋白病的 基因治疗。,2
10、9,基因治疗存在的问题与论理学,基因 治疗的研究与实践中存在若干重要问题，所以更多的是处于研究阶段，临床应用还有待深入。,30,一、导入基因的持续性和高效表达,如何提高基因的持续高效表达，从下列几方面考虑：1、选择高效的基因转移方法；2、选择适当的受体细胞（生命周期长的细胞）3、选择适当的载体（广泛表达或特异性表达的载体，以使Gnen高效表达）,31,二、Gene治疗与社会伦理道德,体细胞Gene治疗符合伦理道德，没有争议。生殖细胞Gene治疗可能改变正常人的遗传特征，存在某些争议。然而生殖细胞的基因治疗又是一个不容回避的课题，因为它比体细胞基因治疗更为彻底。所以，随着分子生物学技术的发展，G
11、en治疗技术的成熟，将回答伦理道德方面的问题，相信生殖细胞的基因治疗将会被人们接受。,32,三、Gene治疗的现状与前景,体细胞Gene治疗临床实验已经开始，生殖细胞Gene治疗正在完善。进行基因治疗必须具备下列条件：,33,具备下列条件,选择适当的疾病，清楚疾病的发病机理，Gene的结构和功能。被纠正的基因已克隆，并清楚Gene表达与调控机制与条件。选择适当的受体细胞并在体外有效表达。安全有效的基因转移方法，以及供利用的动物模型。,34,基因治疗实例,1、复合免疫缺陷综合征的基因治疗（人类Gene治疗成功例子）。ADA缺乏症-致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。,35,ADA-G
12、ene+vector（逆转录病毒）重组分子 患者T Ly C IL-2刺激C分裂 导入 细胞生长分裂 10天 Gene表达 回输患儿体内 12月治疗一次10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%,36,2、乙型血友病,XR，患者凝血因子缺乏，因子基因定位在Xq26.3q27.2。临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。例如：我国学者薛京伦实施的F的基因治疗。,37,逆转录病毒载体+FcDNA 重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3导入仓鼠细胞（CHO）F表达；导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）F表达；91年，导入乙型血友病患者
13、皮肤成纤维细胞（体外培养）回植病人皮下F基因表达，F基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。,38,3、黑色素瘤的基因治疗,肿瘤Gene治疗是人们十分关注的问题，进行了广泛的探索。研究发现，肿瘤浸润淋巴细胞TIL，它积聚肿瘤部位，并在该处持续存在而无副作用，利用此特点协助治疗肿瘤。,39,例：细胞因子基因治疗和肿瘤坏死因子基因治疗,IL-2 Gene TNF-Gene（白介2）（肿瘤坏死因子）逆转录病毒载体 导入 TIL（体外培养的自体细胞）回植患者体内 TIL进入自体肿瘤部位，提高细胞因子杀伤肿瘤细胞 的作用。,40,4、自杀基因的基因治疗,原理：即用（逆转录）病毒载体将编码某种
14、酶的基因（自杀基因）转染到肿瘤细胞中，此酶可将一种无害的药物前体转变为细胞毒复合物，进而杀伤肿瘤细胞（肿瘤细胞不能复制而死亡）。这种基因载体只能在特定的组织或肿瘤中表达，而正常细胞中不表达。,41,如：自杀基因+病毒载体 转染 重组载体,药物前体 无毒Gene酶 药物复合物 有毒,细胞死亡,42,例如：单纯疱疹病毒 哺乳动物细胞 HSV Gene-TK（在肿瘤细胞中表达，正常细胞中不表达）GeneTK GCV（胸苷类似物）TdR P p GCV-p 抑制DNA合成 脱氧胸苷酸 肿瘤细胞死亡 邻近细胞死亡/凋亡（旁观者效应）,43,5、反义核酸基因治疗,反义技术：是指利用人工合成的反义RNA或D
15、NA导入靶细胞，阻断Gene的转录或复制，控制细胞的中间阶段使编码蛋白的Gene不能转录为mRNA 或阻断翻译相应蛋白.,44,反义基因治疗,DNA DNA RNA RNA 反义RNA 阻断表达,45,目前采用的技术：,反义RNA表达载体Vector Cell 转录RNA 阻断mRNA反义RNA/DNA体外微注射质脂体运载反义RNA；其他方法 Cacl2沉淀方法，细胞打孔仪，逆转录病毒导入方法。,46,医学遗传学考试形式简介 一、选择题（20题，每题0.5分，共10分）二、判断正误（20题，每题0.5分，共10分）三、填空题（10题，每题1分，共10分）四、解释概念（10题，每题2分，共20分）五、分析叙述题（5题，每题10分，共50分）复习题由网络学院在网上播出,47,祝大家复习好,取得优异成绩,
