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1、HIV感染和 AIDS的实验诊断,HIV感染及AIDS的实验诊断,揭开AIDS历史的 第一页MMWR JUNE 5,1981/VOL.30/NO.21MORBIDITY AND MORTALITY WEEKLY REPORT,爱滋病是一种有病毒引起的全身性传染病,其定义是血液中查到人类免疫缺陷病毒抗体或其他相关的病毒学指标,机体抵抗感染和疾病的免疫机能受到破坏，而发生的一系列相应症状HIV感染者的定义是血液呈HIV阳性而无症状的感染者。,获得性免疫缺陷综合征(Acquired immuno-deficiency Syndrome,AIDS),1.发展简史 1983年,法国巴斯德研究所分离到一种
2、新的 逆转录病毒，命名为LAV。1984年美国国立 癌肿研究所分离出命名为HTLV-的病毒。同年，美国加州大学分离出AIDS相关病毒（AIDS Related Virus,ARV）.1986年，非洲西部发现了另一种病毒国际微生物学会及病毒分类学会统一命名为HIV。,一）生物学特征,2.HIV的结构与蛋白质功能HIV呈球形或卵形，直径为100-120nm，双层结构。核心由两个相同拷贝的RNA及蛋白质、反转录酶、核糖核酸酶及整合酶组成，核心外为病毒衣壳，20面体立体对称，有蛋白质（P17/P18、P24/P25）。最外层是膜蛋白。包膜上有刺突，含糖蛋白gp120，在双层脂质中有 gp41。,一）生
3、物学特征,HIV病毒颗粒及其结构蛋白和其他毒粒蛋白,人类免疫缺陷病毒HIV,HIV基因编码的产物及其功能,HIV结构蛋白包括:核心蛋白(gag),包膜蛋白(env)聚合蛋白(pol)。核心蛋白包括:P17位于核蛋白与壳层之间的基质上，包被于包膜蛋白的内部。P24和P15包被于内部核酸外围核衣壳主要为P24。包膜蛋白为糖蛋白:gp160 是前体分子，在感染初期产生，然后分解成 gp120 和gp41。聚合酶蛋白包括:P66、P51和P31，聚合酶抗原位于病毒的核区内，与病毒核酸紧密相关。其功能为转录RNA为DNA；整合病毒DNA到宿主细胞的DNA上和切割前体分子使之成为有活性的小分子。,HIV
4、的结构蛋白,HIV-1分为M、O、N三组，M组包括A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个亚型，加上O、N型共12个亚型。HIV-2至少有A、B、C、D、E、F 等6个亚型。,3.HIV的病原特异性：,HIV亚型,A,B,C,D,E,F,G,H,I,J,O,HIV2,SIV,Adapted from:J.Levy HIV and the Pathogenesis of AIDS,HIV1,HIV-1 亚型全球分布,B,a,c,d,f,o,A,O,d,g,h,B,a,d,e,o,B,B,B,B,B,f,c,B,e,B,C,A,D,e,C,a,d,C,a,b,e,C,E,b,E,b,B,e,
5、c,B,e,B,a,c,d,g,h,B,i,UNAIDS Dec.1996,非洲及亚洲部分地区有重组株病毒。,HIV的亚型特点,有相对优势亚型同一亚型差异很大亚型内的变异水平估算存在时间不同亚型传播途径和致病性不一不同亚型对抗-HIV药物引起耐药不同亚型重组,属于逆转录病毒，复制速度快可感染人体各种细胞，造成多器官损伤破坏具有调节免疫系统功能T4淋巴细胞在血液、淋巴液、精液、阴道分泌液和乳汁中其抗体无保护作用对外界抵抗力弱（低于乙肝病毒）,人类免疫缺陷病毒,1.艾滋病成为全球第四大杀手，传染性疾病 的第一大杀手夺取了超过280万人的性命；2.截止2008年，15-49岁HIV患病人数已有400
6、0万，其中40%是15-24岁的青年.(有120万儿童)3.亚洲人感染艾滋病的增长速度最快，尤其 是中国和印度；4.HIV的研究仍跟不上其破坏的速度；5.治疗性控制是可以达到的。,二）流行病学,全球爱滋病感染人数及感染途径,根据联合国爱滋病委员会和世界卫生组织统计，全球每年新感染爱滋病带毒者410万。(24h全球增加16000感染者)因HIV死亡的人数超过了280万,已超过了 肺结核(病死率200万)和疟疾(100万).,1.西方国家HAART的使用，患病率和病死率在下降，而发展中国家AIDS形势严峻；2.以注射吸毒和性传播(以异性间的传播为主)；3.不洁的血液采集;4.女性病例上升；母婴传播
7、5.儿童病例增加（15岁）。,近年AIDS流行特点：,AIDS的流行情况,全国爱滋病患者报告人数已超过65万人 2008年新感染人数已超过7万人 31省市自治区全部发现HIV感染者 三种传播途径均已存在 全国爱滋病的流行经过散发期（1985-1988）、局部流行期（1989-1994），现已进入广泛 流行期（1995至今）爱滋病已成为名副其实的第三世界疾病.,中国的爱滋病近况：,苏州市自92年起共发现艾滋病例600多例,而去年一年的新感染者达190余例,这些统计数字充分表明了我国目前真可谓艾滋病病毒感染的 迅速增长期。(体检发现)联合国艾滋病中国专题组在北京以中国艾滋病：危险的泰坦尼克号为题发
8、布了2001年中国艾滋病形势的最新报告。报告警告说，中国正处在艾滋病灾难的边缘，一艘巨轮正在冲向冰山。,1.HIV借助CD4受体结合到靶细胞表面，通过靶细胞的内吞作用和 gp 41的融合作用，其细胞膜被穿透，病毒进入细胞质；2.在RT作用下，第一条RNA转录为DNA，继之以第一条DNA为模板，形成前病毒；3.在整合酶作用下，形成的双股DNA整合到宿主细胞中，感染持续存在；4.前病毒成为潜伏状态；5.前病毒DNA复制，具有新一代病毒的遗传物质；6.复制好的新病毒颗粒，再感染别的细胞，而原感染的细胞死亡,三）致病机制,2.HIV的感染过程,HIV感染/AIDS过程,窗口期（1-3月）无症状携带阶段
9、，6-15年或更长人体感染HIV后大多经年潜伏期（爱滋病前期）爱滋病期-机会性感染及机会性肿瘤HIV感染者及AIDS病人均具传染性,1.“窗口期”:感染HIV到相应抗体产生.2.“急性感染期”:一般在一月后产生抗体，平均45天。在急性感染期病毒复制明显，血中常可出现P24抗原和HIV RNA，也可培养到HIV。3.“潜伏期”:可持续数月至17年以上。此时仅能检出抗体，但有低浓度HIV复制。4.AIDS临床阶段。,急性HIV感染诱导的宿主免疫应答的进程,HIV的感染过程,HIV的感染过程,感染初期，出现病毒血症，可检出HIV和HIV RNA；血清阳转后可检出多种结构蛋白引起的相应抗体，如P24、
10、P55、gp160、gp120、gp41、P51 等，均为 IgG；抗HIV IgM出现峰度很低，持续时间短；抗 gag 抗体，如P55、P24是常规筛选和确认实验最早检出的抗体；(平均22天)一般均出现血液淋巴细胞下降。CD4细胞数目为最重要反映临床进展的指标；HIV感染者2 m 和新蝶呤水平升高并与其 病程有关。,3.感染后的免疫反应,HIV感染后的血清学变化,1.血清中的HIV抗原在感染后3-4周达到高峰，9-10周逐渐降低甚至消失。HIV抗体出现并维持高水平多年，尤以P41时间最长；2.HIV抗原消失或极少往往表示病毒的潜伏期，在血清中再次大量出现可能已是AIDS晚期。此时HIV抗体下
11、降。,HIV感染的血清学变化,4.HIV感染后的T细胞变化,CD4+T持续不断下降，及Th1,Th2亚群失调对抗原反应性减低细胞因子如IFN-r,TNF-a水平升高，产生细胞因子的功能受损，如IL1,IL2能力下降；CD8+T早期有较明显上升，发病前1-2年明显下降，CTL功能下降，但如加IL-2处理可恢复活性。CD3+T在早期下降不明显，在AIDS发病前1-2年出现明显下降。,CD4+淋巴细胞的格局,HIV的病毒培养与分离；HIV的毒株分析；HIV核酸测定；（Abbott LCx HIV-RNA）P24抗原的测定；第四代酶免试剂HIV抗体测定：常分为初筛和确认两步。初筛实验室和常用初筛方法有
12、：HIV病毒抗体金标快速法（Instant CHEK-HIV1+2）爱滋病毒抗体筛选酶免试剂（MUREX HIV）Determine HIV1+2+0亚型试纸（Abbott）双抗原夹心酶免试剂 确认试验主要是免疫印迹技术（Western Blot,WB）,四）HIV的实验诊断,1.HIV抗体检测,试剂盒1985.3 HIV-11990.6 HIV-21992.4 HIV-1/2敏感度和特异度不断提高三代ELISA均达99%以上.1998.三代ELISA检测IV1/HIV2(P24Ab).2008.四代ELISA(IV1/HIV2(P24Ag)快速诊断试剂(胶体金标记),EIA实际试剂盒进展,代
13、次 抗原 方法 检测时间1 全病毒 间接 2个月2 重组或多肽 间接 42-45d3 重组+多肽 夹心 22d4 抗原+抗体 夹心 16d(抗原5pg)5 基因扩增法，基因芯片 6-11.5d,HIV抗体筛查试剂,1.Murex HIV 1.2.O：第三代抗体试剂的双抗原夹心法模式两步法酶标法测试，可以用来检测HIV抗体I型，II型和O亚型。手工/自动化酶标仪检测，用血清/血浆样本。,Murex HIV-1.2.O.夹心模式,板底,样本,结合物,抗原包被（1）,辣根过氧化物酶标记抗原（2）,模式：双抗原夹心法。,Murex HIV-1.2.O 抗原,HIV-1 env,POD,POD,POD,
14、HIV-O,HIV-2,多肽抗原,重组抗原,板,结合物,CD SD,POD,HIV-1 p24,P41/p36,前带/后带效应的机制,两步冲洗法-可避免此效应,低浓度的结合物,高浓度的结合物,HOOK效应的机制,Ag 变构是二步夹心酶免出现钩状HOOK的原因被测抗原如具有多重决定族与亲和性高于包被抗体的酶标抗体发生交叉重叠结合，由于立体效应和互相挤压，Ag分子发生构象改变而从包被抗体上脱落，造成反应信号下降,2.POCT 在艾滋病毒检测中的应用,快速Determine HIV1/2 O抗体检测,第三代抗体试剂的双抗原夹心法模式可以用来检测HIV抗体I型，II型和O亚型。可用手指/静脉血，15分
15、钟出结果，可用血清/血浆/全血样本结果可密封保存。,快速试剂研制的背景,就地检测（POCT）概念：急诊-手术，紧急输血，事故紧急检测。（医护人员和病人的保护）筛查概念：母婴筛查，就职，移民，性及吸毒犯罪人员体检等-简单易用。日常检测：大，中，小型实验室，及极少量HIV样本实验室，偏远地区，实验室条件或设备不齐，外出检测-方便携带，使用。结果可保存。,灵敏度排名及分数,3.第四代试剂及抗原有关的试剂,HIV 抗原/抗体联合试剂：Murex HIV Ag/Ab：第四代试剂大大提高灵敏度的筛查试剂，进一步缩短了 检测“窗口期”。RIA Delta HIV Ag/Ab：放免HIV抗原/抗体联合试剂。H
16、IV抗原试剂：Murex HIV抗原单克隆试剂：临床上只用于HIV抗原检测以早期检测样本，或观察HIV 疾病进程。Murex HIV 抗原确认试剂,确认抗原试剂阳性样本。,HIV 标记物,CDCgroup I,CDCgroup II/III,CDCgroup IV,HIV Ag/RNA,IgM,IgG(env),IgG(p24),HIV Ag/RNA,第一代,第二代,第三代,第四代,抗原补充,4.HIV特殊试剂,HIV 抗体WB确认试剂：为唯一一种经典和全球公认的抗体确认试剂，2.2版本包含有极早期血清转换片段，便于早期样本的确认。LCx HIV 核酸物质定性/定量分析：（LCR和PCR技术）
17、用于HIV 病人遗传物质检测，可用于部分确认，和病人治疗监测。,Western Blot分析HIV 蛋白,Western blot原理,HIV病毒核酸分析和血清学免疫测定比较,血清学免疫测定核酸分析,感染后天数,天,血清HIV抗体,核酸分析,5.自身红细胞凝集试验原理,双功能试剂：抗RBC,gp120简单，快速，微量，不需分离血清有假阳性,6.HIV亚型分析；HIV变异的识别；7.细胞因子的测定；8.PCR追踪HIV自然感染史。,HIV的实验诊断,世界爱滋病日,1988年月将每年的月日定为世界爱滋病日，号召世界各国和国际组织在这一天举办相关活动，宣传和普及预防爱滋病的知识在加拿大举行的第16届国际爱滋病大会,美国前总统克林顿和微软公司比尔.盖茨 均出席会议.”时不我待”爱滋病会议永远 是政治会议.(探讨消除歧视,提高人权和全民享有医疗),结束语,艾滋病问题的解决尚无固定的时间表,也不会有奇迹出现.必须准备与艾滋病长期共存.随着对HIV实验诊断试剂盒和新技术的不断进步,早期检测才有可能;如果没有PCR方法的建立不可能对HIV的基因结构有透彻的了解.为此,只有随着人类社会及科学的不断进展,通过无数人的努力艾滋病才可能被征服.,谢 谢,
