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1、第十一章动物细胞大规模培养 教 学 内 容,1、动物细胞培养基 2、动物细胞培养方法 3、动物细胞培养生物反应器 4、动物细胞培养技术 5、动物细胞大规模培养工艺,第十一章 动物细胞的大规模培养,本章内容提要,在生物技术中，人们已广泛地围绕着细菌、酵母、丝状真菌等微生物的大量培养来生产各种酶、抗生素、蛋白质等产物。然而，许多有重要价值的蛋白质等生物物质，必须借助于动物细胞的培养来获得，例如病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等，如表11-1所示的是一些已实现工业化和正在研究开发的产品。大规模的动物细胞培养开始于本世纪50年代，经过多年来的研究，人类对动物细胞培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大的进
2、展。尽管如此，目前的技术水平还远不能满足细胞生物产品研究和生产的要求，随着动物细胞培养技术的应用日趋广泛，已显示出很广阔的发展前景。,目前由动物细胞培养的产物包括哪几类？请分别列举出2-3个产物。,问题,表11-1 动物细胞培养的产物,补充内容（一）,单克隆抗体,哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。抗体最早是由德国微生物学家贝林发现的，它们存在于人和脊椎动物的血清之
3、中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以消灭抗原，因此抗体在基础研究和临床诊断中获得了广泛的重视和应用。随着杂交瘤技术、蛋白质工程和转基因技术等技术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。,抗体,由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。,抗原,指诱导产生抗体的物质。,如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的
4、防卫系统。对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。由于一个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。,有毒物质或病原物侵入，即抗原,侵入,抗体2,抗体1,于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。,多克隆抗体,在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。,单克隆抗体,由杂交瘤细胞
5、系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。,补充内容（二）,动物细胞培养步骤,培养动物细胞一般可按以下步骤进行：,无菌取出目的细胞所在组织，用培养液漂洗干净,以锋利无菌刀具割舍多余部分，切成小组织块,将小组织块置解离液离散细胞。解离液含蛋白酶类，无钙、镁离子,低速离心洗涤细胞后，将目的细胞吸移培养瓶培养,一、动物细胞培养基,1、动物细胞培养的环境,动物细胞的生长、繁殖和代谢等生理性质在很大程度上受到各种环境因素的影响。为了使动物细胞的培养处于最佳状态，了解环境因素对其影响无疑是很重要的，影响动物细胞生长、繁殖的环境因素很多，主要有温度、PH值、营养成分、溶氧、气体环境、渗透压以及其他因素
6、。,温 度,细胞在体外生存的基本条件之一，来源不同的动物细胞，其最适的生长温度是不尽相同的，例如昆虫细胞的最适温度是25-28，人和哺乳动物的细胞的最适温度是37.细胞代谢强度与温度成正比，高于最适温度范围，细胞的正常代谢和生长将会受到影响，甚至导致死亡。总的来说，动物细胞对低温的耐受力比对高温的耐受力强，如温度升至45时，1h内人和哺乳动物细胞将被杀死；相反，降低细胞置于25-35时，细胞仍能生长，但速度减慢，并维持长时间不死，甚至于放在4，数小时后再置于37培养，细胞仍能继续生长。,PH 值,合适的PH值是细胞生存的必要的条件之一。动物细胞合适的PH值一般在7.2-7.4，低于6.8或高于
7、7.6时都对细胞产生不利的影响，严重时可导致细胞退变或死亡。不同的细胞对PH值也有不同的要求，原代培养细胞对PH值的变化耐受性差，传代细胞对PH值变化的耐受性较强。而对于同一种细胞，增长期和维持期的最适PH也不尽相同，对于大多数细胞来说，偏碱性环境比酸性环境更有利于细胞的生长。,营养成分,细胞的生长、繁殖以及产物的合成都必须从环境中摄取各种营养物质，以合成细胞物质及在新陈代谢中起调节作用。这些营养物质包括碳源、氮源、氨基酸、无机盐、微量元素、生长因子等。,溶氧及气体环境（P205）,渗透压等其它因素（P205）,1、影响动物细胞生长、繁殖的环境因素有哪些？,问题,2、动物细胞培养合适的PH值为
8、多少？,2、培养基的组成,培养基是维持体外细胞生存和生长的基本溶液，是组织细胞培养最重要的条件。用于动物细胞的培养基可以分为天然培养基和合成培养基两 大类。,天然培养基是使用最早、最为有效的动物细胞培养基，它主要取自于动物体液或从动物组织分离提取而得，其优点是营养成分丰富、培养效果良好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。,天然培养基的种类有很多，包括生物性液体（如血清）、组织浸出液（如胚胎浸出液）、凝固剂（如血浆）等。,3、溶氧浓度过高过低对细胞生长有何影响？,4、细胞代谢产物CO2对细胞生长有何作用？,1、天然培养基有哪些？它有何优缺点？,问题,2、血清和血浆分别如何取得？,血液组成：红
9、细胞、白细胞、血小板和血浆。高速离心，分三层：上层为血浆40%多。,血浆冷冻到-30度，离心，分层：上层为血清，下层为杂蛋白（少）。,3、最广泛使用的血清是什么动物血清？它有何营养成分？,血浆,组织浸出液,血清,组织细胞培养中最常用的天然培养基是血清，这是因为血清中含有包括大分子的蛋白质和核酸等丰富的营养物质，对促进细胞生长繁殖、粘附及中和某些物质的毒性起着一定的作用。用于组织细胞培养的血清的种类很多，其来源主要动物，有小牛血清、胎牛血清、马血清、兔血清以及人血清等，最广泛使用的是小牛血清和胎牛血清。优质的血清外观应为透明、无溶血、淡黄色、无沉淀物。,血浆不仅可用来支持培养组织块，而且还供给细
10、胞生物匠营养物质，但由于血浆很容易发生液人经，目前已很少单独使用。一般使用的是禽类血浆。,组织浸出液常用的是胚胎浸出液（如鸡胚浸出液），它的主要成分含有大分子核蛋白和小分子的氨基酸，有促进细胞生长的作用。,水解乳蛋白,水解乳蛋白是常用的一种天然培养基，是由乳白蛋白经水解而制得，氨基酸的含量较高。一般配制成0.5%的溶液，或与合成培养基以1：1共同使用。,合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中各种已知物质在体外人工条件的模拟，经过反复实验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。这种培养基在很多方面有天然培养基所无法比拟的优点，它既能经细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于
11、控制和提供标准化体外生存环境。,目前所有的细胞培养都已采用经标准化生产、组成和含量都相对固定的各种合成培养基，并已有配制好的干粉型商品。尽管现在的合成培养基成分和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要，合成培养基中还是需要加入一定量的天然培养基予以补充。,合成培养基中一般都有哪些营养成分？,问题,3、常用的合成培养基,目前合成培养基的种类已有数十种，大多数培养基都是为适应某种组织细胞的生长而在某种合成培养基的基础上改良而来的。目前较为常用的有199培养液、Eagle(MEM、DMEM)培养液、RPMI1640培养液、HAM培养液等。表11-2为常用的培养基的成分和配方。,1
12、、目前较常用的合成培养基有哪些？,问题,2、为什么在要求较高的基础性研究中要用无血清培养液？,3、无血清培养液由哪两部分组成？P208,表11-4 微生物细胞和动物细胞性质的比较,二、动物细胞培养方法,所谓动物细胞培养是将动物组织或细胞从机体取出，分散成单个细胞，给予必要的生长条件，模拟体内生长环境，使其在体外继续生长和繁殖。表11-4，表11-5是微生物细胞与动物细胞性质和培养方法的比较。,表11-5 微生物和动物细胞培养方法的比较,与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要
13、附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。,1、悬浮培养 P209,1、动物细胞培养有哪三种类型？,提问,1、悬浮培养是用培养哪一类细胞的？,问题,2、悬浮培养有何优缺点？,2、贴壁培养,贴壁指必须贴附在固体介质表面上生长的细胞培养培养，主要用于非淋巴组织和许多单倍体等贴壁依赖性细胞的培养。由于大多数动物细胞属于贴壁依赖性细胞，贴壁培养是动物细胞培养的一种重要方法。,在贴壁培养过程中，贴壁依赖性细胞需要附着在带适量正电荷或半固体的表面上，原来是圆形的细胞一经贴壁就迅速铺展开来，然后开始有丝分裂，并很快进入对数生长期。一般可在数天后铺满生长表面，形成致密的细胞单层。,在贴壁培养依赖性细胞中，请比
14、较滚瓶培养系统和微载体培养系统？,问题,细胞贴壁一般分为贴壁因子吸附于培养表面、细胞与表面接触、细胞贴壁于培养表面和贴壁细胞在培养表面上扩展等几个步骤。图11-1为细胞在培养表面贴壁过程示意图。,3、固定化培养,固定化培养是既适用于贴壁依赖性细胞，又适用于非贴壁依赖性细胞的包埋培养方式，具有细胞生长密度高、抗剪切力和抗污染能力强等优点。由于所培养的细胞的不同，固定化培养的方式也有不同，一般对于贴壁依赖性细胞通常采用胶原包埋，而对于非贴壁依赖性细胞则常用海藻酸钙包埋。常用的细胞固定化的方法主要有吸附、共价贴附、离子/共价交联、包埋和微囊化等。,三、动物细胞培养生物反应器,自70年代以来，用于动物
15、细胞培养的生长反应器有了很大的发展，种类越来越多，规模也越来越大。根据生物反应器的不同用途，有悬浮培养用、贴壁培养用、包埋培养用生物反应器等，其种类大致上有塑料增殖器、填充床增殖器、多层板增殖器、螺旋增殖器、管式螺旋增殖器、陶质矩形通道蜂窝状增殖器、流化床反应器、中空纤维及其他膜式反应器、桨式搅拌反应器、棒式搅拌反应器、船舶推进桨反应器、倾斜桨叶搅拌反应器、般帆形搅拌反应器、往复振动锥孔筛板搅拌反应器、笼式通气搅拌反应器、双层笼式通气搅拌反应器、空气提升式反应器等。,1、气升式细胞培养生物反应器,气升式反应器的基本原理如图11-2所示。气体混合物从底部的喷射管进入反应器的中央导流管使得中央导流
16、管侧的液体密度低于外部区域从而形成循环。气升式生物反应器主要采用内循环式，但也有采用外循环式。,与搅拌式生长反应器相比，气升式生物反应器产生的湍流温和而均匀，剪切力相当小，反应器内没有机械运动部件，因而细胞损伤率比较低；同时由于采用直接喷射空气供氧，氧传递速率高；液体循环量大，能使细胞和营养成分均匀地分布于培养基中。,表11-9列出了八种细胞的有关培养数据，可以看出同传统的方法（培养瓶和滚瓶）相比，气升反应器的抗体产量平均提高4.6倍。,在气升式生物反应器中，溶氧的控制可以通过自动调节进入空气的速率来实现；PH值可通过在进气中加入二氧化碳或加入氢氧化钠来控制。,优点,请画出气升式反应器的简图，
17、并说说溶氧浓度和PH值是如何控制的？,问题,表11-9 气升式反应器和传统培养方法的抗体产率比较,图11-3 中空纤维反应器示意图,细胞,培养基入口,培养基出口,2、中空纤维管生物反应器,中空纤维管生物反应器如图11-3所示，它的用途较广，既可培养悬浮生长的细胞，又可培养贴壁依赖性细胞，细胞的密度最高可达109/ml数量级。如果控制系统不受污染，能长期运转。已用这种反应器培养过的细胞型和生产的分泌产物如表11-10所示。,空气与CO2出口,空气与CO2入口,中空纤维管生物反应器已进入工业生产，主要用于培养杂交瘤细胞生产单克隆抗体。（重点掌握）,3、通气搅拌反应器,通气搅拌反应器有哪些型式？,问
18、题,4、流化床生物反应器,流化床生物反应器的基本原理类似于流态床化学反应器，不同的是，流态化的固体是带有细胞的微粒。培养液通过反应器垂直向上循环流动不断提供给细胞必要的营养成分，使细胞得以在微粒中生长；同时，不断地加入新鲜的培养液，并不断地排除培养产物或代谢产物。图11-7为生产用CF-IMMOTM流化床生物反应器的示意图，这种反应器的传质性能很好，并在循环系统中采用膜气体交换器，能快速提供给高密度细胞所需的氧，同时排除代谢产物；反应器中的液体流速足以使细胞微粒悬浮却不会损坏脆弱的细胞。由于流化床生物反应器满足了高密度细胞培养、使高产量细胞长时间停留在所应器中、优化细胞生长与产物合成的环境等细
19、胞培养的要求，流化床生物反应器既可用于贴壁依赖性细胞的培养，又可用于非贴壁依赖性细胞的培养。表11-11为流化床生物反应器达到的细胞密度。,气体交换,氧气,回流,收获,营养液,泵,反应塔,加热器,PH,传感器,T,DO,CO2,图11-7 生产用CF-IMMOTM流化床生物反应器示意图,5、无泡沫搅拌生物反应器（了解）,表11-11流化床生物反应器与其它方法培养达到的细胞比较,四、动物细胞培养技术,动物细胞无论是贴壁培养或是悬浮培养，均可分为分批式、流加式、半连续式、连续式等多种培养方式。,1、分批式培养,定义,分批式培养是指先将细胞和培养液一次性装入反应器内进行培养，细胞不断生长，同时产物也
20、不断形成，经过一段时间的培养后，终止培养。,在细胞分批培养过程中，不向培养系统补加营养物质，而只向培养基通入氧，能够控制的参数只有PH、温度和通气量，因此细胞所处的生长环境随着营养物的消耗和产物、副产物的积累时刻都在发生变化，不能使细胞自始至终处于最优的条件下，因而分批培养并不是一种很好的培养方式。分批培养过程的持征如图11-8所示。,营养物,废产物,PH、温度、DO,对数生长期,减速期,平稳期,衰退期,延滞期,为什么说采用分批式培养细胞效果不佳？,问题,细胞分批式培养的生长曲线如图11-9所示。在分批式培养过程中，细胞的生长可分为延滞期、对数生长期、减速期、平稳期和衰退期等五个阶段。,2、流
21、加式培养（补料分批式）,定义,流加式培养是指先将一定量的培养液装入反应器，在适宜的条件下接种细胞，进行培养，使细胞不断生长，产物不断形成，而在此过程中随着营养物质的不断消耗，不断地向系统中补充新的营养成分，使细胞进一步生长代谢，直到整个培养结束后取出产物。,流加式培养只是向培养系统补加必要的营养成分，以维持营养物质的浓度不变。由于流加式培养能控制更多的环境参数（），使得细胞生长和产物生成容易维持在优化状态。,流加式培养有何特点？（P219）,问题,PH、温度、DO,废产物,营养物,根据流加控制方式不同，有两种流加式培养方式：无反馈控制流加和有反馈控制流加。无反馈控制流加包括定流量加和间断流加等
22、；有反馈控制流加一般是连续或间断地测定系统中限制性营养物质的浓度，并以此为控制指标来调节流加速率或流加液中营养物质的浓度等。,3、半连续式培养,半连续式培养又可称为反复分批式培养，是指在分批式培养的基础上，将分批培养的培养液部分取出，并重新补充加入等量的新鲜培养基，从而使反应器内培养液的总体积保持不变的培养方式。,定义,4、连续式培养,连续式培养是指将细胞种子和培养液一起加入反应器内进行培养，一方面新鲜的培养液不断加入反应器内，另一方面又将反应器液连续不断地取出，使反应条件处于一种恒定状态。,定义,与分批式培养和半连续式培养不同，连续式培养可以保持细胞所处的环境条件长时间地稳定，可以使细胞维持
23、在优化的状态下，促进细胞的生长和产物的形成。由于连续式培养过程中连续不断地收获产物，并能提高细胞密度，在生产上已被应用于培养非贴壁依赖性细胞。,请比较半连续式培养和连续式培养？,问题,图11-14 细胞灌注培养系统实例,液位控制,细胞悬液,细胞,新鲜培养基,收液,过滤器,细胞培养系统,动物细胞的连续培养一般是采用灌注培养。灌注培养是把细胞接种后进行培养，一方面连续向反应器中注入新鲜的培养基，同时又连续不断地取出等量的培养液，但是过程中不取出细胞，细胞仍留在反应器内，使细胞处于一种营养不断的状态。当高密度培养动物细胞时，必须确保补充给细胞以足够的营养以及除去有素毒的代谢物。灌注培养时用新鲜的培养
24、液进行灌注，可以确保上述目的的实现。通过调节灌注速度，可以把培养过程保持在稳定的、废代谢物低于抑制水平的状态下。灌注培养过程的特征如图11-13所示。,PH、温度、DO,废产物,营养物,表11-12不同培养方式对CHO细胞生产人组织血纤维溶酶原激活剂（tPA)产量和活性的影响,采用灌注培养的优越性不仅在于大大提高了细胞生长密度，而且有助于产物的表达和纯化。如表11-12及图11-14所示，因此，灌注培养已经应用于许多不同的培养系统中，规模已达几百升。图11-14为常用的细胞灌注培养系统。,说说灌注培养的优越性？,问题,5、动物细胞大规模培养工艺,大规模动物细胞培养的工艺流程如图11-15所示。
25、工艺过程中，先将组织切成碎片，然后用溶解蛋白质的酶处理而得到单个细胞，再用离心法收集细胞。将细胞植入营养培养基，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再接种到若干培养瓶中进行扩大培养，将培养所得的细胞“种子”冷藏于液氮中，从液氮中取出一部分细胞“种子”进行解冻、复活培养，进行扩大培养以获得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行大规模培养，按照产物的不同形式进行产物分离纯化。对于积累在细胞内的产物，可通过收集细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物，可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收集细胞，再经分离纯化得到产物。,图11-15 大规模动物细胞培养工艺流程图,细胞培养反应器,提取,细胞,诱生剂,细胞,产品（肿瘤抗原）,纯化,产品（干扰素）,纯化,提取,产品（单克隆抗体）,浓缩纯化,7,9,8,6,5,4,3,2,1,10,Thank you！,END,
