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1、呼吸道九联检病原体抗体检测及其临床意义,检验科 杨溪霖,呼吸道感染,呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统分为上呼吸道感染和下呼吸道感染,上呼吸道感染,常见急性上呼吸道感染，指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症,下呼吸道感染,包括急性气管/支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素,呼吸道病原体,常
2、见的呼吸道病原体主要有病毒、细菌、支原体、衣原体和立克次体等据统计，90%以上急性呼吸道感染由病毒引起一种病原体可引起多种临床症状，同一临床表现可由多种病原体引起,呼吸道病原体感染概况,一、典型“致病菌”细菌：肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌、流感嗜血杆菌、卡他莫拉菌等 症状：典型，咳嗽、脓性痰、胸膜炎性胸痛，一般都伴有发热，或有脓血痰 病史：悠久，古代的“瘟疫”很多细菌性肺炎 重症致死性肺炎很多是细菌性 上世纪50年代以前的肺炎90%以上为细菌性肺炎，现在报道约在40%左右 肺炎链球菌大约占在60%,呼吸道病原体感染概况,二、非典型病原体进展的、开放的概念，始用于20世纪30年代末，60年代首次发
3、现了非典型的病原体肺炎支原体泛指各种能引起肺炎的、临床表现与典型肺炎不同的各种病原体（广义）临床症状不典型，差异大在CAP中感染的比例逐年增加，据报道大约占40-60%，逐渐引起各国医疗工作者注意,（一）最常见的非典型病原体,肺炎支原体、肺炎衣原体、军团菌等（狭义的非典型病原体）感染比例高，超过“非典”50%临床症状：干咳为主，少痰或无痰，肺外症状较常见明显，尤其军团菌感染，表现相对较重，多脏器受累明显。可有高热、耳鸣、相对缓脉、血尿、腹痛、腹泻、肝酶升高、电解质紊乱、精神神经症状等-内酰胺类（青霉素类、头孢类）、氨基糖苷类（链霉素）等药物无效治疗：呼吸喹诺酮类、大环内酯类,（二）病毒类,流感
4、病毒、副流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒、冠状病毒、禽流感病毒等季节性或区域性流行临床症状：干咳为主，少痰或无痰、呼吸困难，低氧血症治疗：主要依靠对症支持治疗。早期抗病毒治疗可能效果较好。预后取决于病毒类型和宿主对病毒的反应,（三）真菌性肺炎,念珠菌，曲菌，新型隐球菌，放线菌，组织胞浆菌，毛霉菌属等除组织胞浆菌为原发吸入性感染外，多数为条件致病多发生在免疫低下患者和长时间接受广谱抗生素治疗的患者,白色念珠菌肺炎,社区获得性肺炎,社区获得性肺炎（community-acquired pneumonia,CAP）是指在非医院环境中受感染因子侵袭所发生的肺部炎症，以及住院后48小时内或特殊病原菌在潜
5、伏期10天内所患肺炎，又称院外获得性肺炎。这种肺炎之所以被叫做”社区获得性肺炎”是由于它很容易从社区中的一个成员传播到另一个。CAP的发病率为4.7%-11.6%，其中22%-51%的CAP需住院治疗；住院CAP死亡率7%，重症CAP死亡率29%。（数据来自西班牙）,社区获得性肺炎,美国：感染率第一位的疾病美国：每年560万感染肺炎，感染率5-10人/1000人/年WHO：第二大死因，仅次于心血管疾病中国：第五大死因中国：儿童死亡的第一病因,各病原体在CAP中感染率,各国社区获得性肺炎指南对非典型病原体的重视情况,肺炎的诊断与治疗研究进展,数据来源：,重视非典型病原体在CAP致病中的作用,要重
6、视非典型病原体在小儿呼吸道疾病中的致病作用等,呼吸道病原菌合并感染的分析,119例小儿肺炎细菌感染97例，细菌感染及肺炎支原体同时感染19例。-检验医学与临床2009年12月第6卷第23期在SARS发病前阶段，合并MP感染阳性率为693(3956)；发病后阶段，合并MP感染阳性率为l86(843）-Joumal of Tropical Medicine Vo13 No3 Sep2003Mpn和Cpn合并阳性有27例占总阳性数的450-中国优生与遗传杂志2001年第9卷第3期9例(12)患儿MP-IgM 和CpnIgM 同时阳性；-世界感染杂志2006年第6卷第4期本次调查同时检测了8种感染呼吸
7、道的常见病毒，结果提示Mp、Cp多混合有病毒感染。-中国人兽共患病杂志：1002-2694(2005)030269-02,社区获得性肺炎,青霉素问世前：CAP80%以上是由肺炎链球菌所致。1928年英国科学家弗莱明发现青霉素：拯救了千百万肺炎患者的生命，肺炎链球菌虽仍是CAP最常见的病原体，但比例已明显下降。非典型的病原体：如：肺炎支原体、肺炎衣原体、病毒、嗜肺军团菌等，明显上升!在非典型病原体感染中，支原体肺炎 病毒性肺炎 尤其最为常见。,非典型呼吸道病原体,这些病原体变异快，传播广，由于不易形成长期免疫力而难以预防和控制,流感病毒 副流感病毒病毒 呼吸道合胞病毒 腺病毒,呼吸道病原体检测,
8、现有的主要方法：病毒分离培养抗原检测抗体检测分子生物学方法等,检测方法的比较,采样,抗原检测拭子伸入鼻部后向鼻咽部水平伸入，不是向鼻腔伸入。伸入距离为从耳垂部到鼻尖长度的一半，一般针对两周岁以下儿童，伸入距离约为拭子绒毛头的长度两倍拭子伸入后要轻轻捻动拭子转3圈。取样后在一小时之内洗脱到生理盐水中，12小时内送检,抗原检测采样,采样对结果影响较大非典型感染多为干咳，无痰/少痰阳性率低（标本问题，病毒颗粒小）抗原在体内存在时间短,抗原检测的劣势,采样,抗体检测,检测样本要求 本试剂盒仅适用于检测人血清。其血液采集需由专业人员无菌静脉穿刺采集。建议使用消毒或无菌技术，以保持样本的完整性。血清样本采
9、集后如不在8小时内检测应28 C冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-20C）保存。不要反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是IgM。不要使用高血脂或污染的血清。若样本中含有微粒要离心使之澄清。,九项呼吸道病原体IgM抗体检测试剂,九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测,常见检测的九种非典型病原体,嗜肺军团菌肺炎支原体Q热立克次体肺炎衣原体,腺病毒呼吸道合胞病毒流感病毒(甲型、乙型)副流感病毒,嗜肺军团菌,广泛分布于天然淡水或人工水域，革兰氏阴性短杆菌易感人群：通常为老年人、儿童、吸烟者、等免疫功能低下者。流行：夏秋季节。尤其是在装有中央空调的封闭空间内易爆发。军团菌肺炎潜伏期为2-10天，症状：发
10、冷、不适、肌痛、头晕、头痛，并有烦躁、呼吸困难、胸痛。IgM抗体在感染后1周左右出现，并可持续存在3-6个月。我国各省市每年均有病例报告。阳性率2%-5%,肺炎支原体,肺炎支原体，是介于病毒与细菌之间的一种没有细胞壁的病原体经14-21天的潜伏期开始发病，患者有头痛、乏力、无力干咳等症状IgM抗体一般在感染后1周出现，3-4周达到高峰，可持续存在3-6个月学龄儿童、婴幼儿、青少年患病较多，儿童中最典型的综合症是气管支气管炎，许多成年感染者是无临床症状的社区获得性肺炎患者中由肺炎支原体引起的达40%冬季较多，地区性流行,Q热立克次体,Q热立克次体，是介于最小细菌和病毒之间的一类独特的严格在活细胞
11、内寄生的原核细胞型微生物 病原体储存于动物中，传染源主要是受染的牛，羊等家畜，在动物间以蜱传播。动物感染后多无症状，但乳汁，尿，粪中可长期带有病原体。对人的感染力特别强，是立克次体中唯一可不借助于媒介节肢动物而通过感染动物的排泄物污染环境后，通过接触气溶胶感染呼吸道。消化道等途径感染。大部分病例发于春天或是初夏。其流行行分布全世界，我国吉林、四川、云南、新疆、西藏、广西、福建、贵州等十几个省市、自治区均有本病流行。其潜伏期1239天，平均18天。IgM抗体一般在感染后2周左右出现，4-8周达高峰，可持续存在3-4个月。症状主要是高热，剧烈头痛，寒颤，严重乏力，肌痛，且常有胸痛，体温升高。阳性率
12、1%-2%,肺炎衣原体,肺炎衣原体是一种比细菌小但比病毒大的生物，专性细胞内寄生感染方式：人与人可通过呼吸道分泌物传播8岁以上儿童易被感染，尤其是人群聚集处。肺炎衣原体肺炎占社区获得性肺炎比例的10%左右多数起病缓慢，潜伏期30天左右，IgM抗体在发病2-3周出现，一般来说可持续存在2-6个月。临床开始出现流感样的症状如咽痛、头痛、发热。阳性率一般在1-5%左右,腺病毒,腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，其很多与人类上、下呼吸道感染密切有关。腺病毒肺炎多发生于724月婴幼儿。起病时潜伏期2-14天，IgM抗体在发病1周左右出现，可持续存在2-3个月。冬春两季常见，腺病毒肺炎约占病毒性肺炎的2
13、0%30%。阳性率：15%-25%，居病毒性肺炎的第二位；,呼吸道合胞病毒,呼吸道合胞病毒是RNA病毒；呼吸道合胞病毒（RSV）是婴幼儿下呼吸道感染(包括毛细支气管炎和肺炎)最重要的病因之一，可能是致命性的；在年长儿和成年人中也非常常见。在冬季爆发流行。呼吸道合胞病毒感染的潜伏期为3-7天，IgM抗体在发病1周左右出现，可持续存在23个月；占病毒性肺炎的25%-35%左右；位居儿童病毒性肺炎第一位；,流感病毒,流行性感冒病毒是一种造成人类及动物患流行性感冒的RNA病毒，呈球形；根据其核蛋白的抗原性可以分为三类:甲型、乙型、丙型该病毒呈季节性周期性流行爆发（12月-4月）甲型流感的流行每年都会发
14、生 乙型流感的流行只在每3-6年爆发一次，感染人数超过总人口的25%流感病毒的潜伏期为1-7天，IgM抗体在发病1周左右出现，可持续存在2-3个月,副流感病毒,常常引起儿童下呼吸道感染的一种病毒，其致病性仅次于呼吸道合胞病毒，它是单链的RNA病毒副流感病毒的潜伏期为2-7天，IgM抗体在发病1周左右出现，可持续存在2-3个月 副流感病毒感染全年均可发生，第1和第2型副流感病毒感染常见于幼儿，局部流行发生于托儿所，儿科病房，小学及其他儿童场所。第3型为地方性流行，传染性强阳性率：10%-20%临床无法做出副流感的诊断，只能通过实验室检测来诊断,病原体潜伏期 IgM抗体产生时间,抗原抗体检测,Ig
15、MIgG,检测原理,间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应，用免疫荧光显微镜观察结果,实验步骤1,样本的稀释：血清标本与PBS按1:1比例稀释稀释后的血清加入吸附剂中，彻底混匀。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测,实验步骤2,4.显微镜观察,5.结果判读 1）阳性结果：可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光（在副流感病毒和呼
16、吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。,2）阴性结果：可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。,嗜肺军团菌,阴性：荧光弱、少、不规则,嗜肺军团菌,阳性：荧光密集，且亮度较好，杆状形态,肺炎支原体,阴性：红色细胞周围无或少量荧光，亮度弱,肺炎支原体,阳性：荧光占视野50%以上，亮度好，形态为明显的细胞膜或胞浆,Q热立克次体,阴性：荧光弱、少、不规则,Q热立克次体,阳性：荧光亮度强且数量多，形态典型,肺炎衣原体,阴性
17、：荧光弱、少,肺炎衣原体,阳性：荧光密集，且亮度较好,腺病毒,阴性：荧光弱、少,腺病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,呼吸道合胞病毒,阴性：荧光弱、少,呼吸道合胞病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,甲型流感病毒,阴性：荧光弱、少,甲型流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,乙型流感病毒,阴性：荧光弱、少,乙型流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,副流感病毒,阴性：荧光弱、少,副流感病毒,阳性：荧光亮度强且数量多，平均每个视野的阳性细胞3-5个,总结,1、一卡九项，范围更广，不仅可以
18、检测五项病毒，而且可以检测肺炎支原体、肺炎衣原体、嗜肺军团菌、Q热立克次体2、检测IgM抗体，利于早期发现，采用间接免疫荧光法，操作简便，结果快速3、标本为血清标本，容易采集、容易保存4、镜下荧光形态清晰，容易判定5、观察荧光，准确性好6、准确检测出哪种病原体感染，能为临床诊断、治疗提供强有力的帮助,临床问题总结,1、查到病毒阳性临床意义大不大？病毒性呼吸道感染虽属于自限性疾病，主要引起上呼吸道疾病，但具有较强的传染性，而且可引起严重并发症病毒性呼吸道感染疾病的预后取决于病毒类型和宿主对病毒的反应临床主要依靠对症支持治疗，早期抗病毒治疗可能效果较好。,2.与凝集法查支原体不同在哪里？哪种方法准
19、确？为什么？,凝集法检查的是总抗体IgM和IgG，九联检是检测IgM在初次感染和再次感染的过程中，IgG和IgM抗体有不同的表现方式：初次感染时，几乎在所有的情况下IgM和IgG均出现（IgM早于IgG出现）；而再次感染时可能不出现IgM，因此IgM的检测是唯一有用的诊断方法。在许多疾病中病人的一生都可能存在高滴度的IgG，而IgM一般情况下仅在感染后23个月存在于血清中，因此是近期感染的一个有效标志物。再次，对与婴儿来说，因为出生前母体的IgG会被动的传递给了胎儿，所以对6个月以下的婴儿IgM检测是更为有用感染标志物,3.有一位病人，临床表现为典型的病毒感染，九联查出来是阴性？医生有疑惑,检
20、测时间？抗体峰值？再次感染？九种病原体之外的病毒感染？,4.呼吸道九联检能否查H7N9?,九联检甲型流感血清学反应主要针对的是：所有血清亚型中常见的非可变区蛋白（基质蛋白和核衣壳蛋白）的免疫学反应。所以没有必要每年改变包被的菌株。九联检能够检测到其他甲流血清亚型共同抗原表位引起的免疫反应。临床免疫检验手册第六版摘录如下：用细胞或蛋黄培养的病毒检测针对核衣壳和基质蛋白的抗体，由于存在型的特异性，不需要每年改变包被的抗原。这些检测在检验中被广泛应用，特别是那些正在流行没有被分离出的抗原。病原体感染人体后，一般于1周左右产生抗体，2周左右达到高峰，以后逐渐降低至消失，可在体内存留2-3个月左右,呼吸道传染病的预防措施 避免受凉 净化环境 管理传染源，切断传播途径 补充营养 注意生活规律 加强个人卫生和个人防护 自动免疫,谢谢！,
