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1、第十章 园艺植物遗传转化,李 英(南京农业大学园艺学院)Tel:025-84395756 生科楼B6018E-mail:,第一节 园艺植物遗传转化受体系统第二节 园艺植物遗传转化方法第三节 园艺植物转化植株的鉴定第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略第五节 基因沉默技术与基因剔除技术第六节 外源基因在园艺植物中的遗传,第十章 园艺植物遗传转化,植物遗传转化(plant genetic transformation),定义:是应用分子重组技术、细胞组织培养技术或种质系统转化技术,有目的地将外源基因或DNA片段插入到受体植物基因组中,并使其在后代植株中得以表达的过程。目的:提高产量,品质
2、和抗性,第一节 园艺植物遗传转化受体系统,植物遗传转化受体系统：指用于转化的外植体通过组织培养途径或其他非组织培养途径，能高效、稳定地再生无性系，并能接受外源DNA整合，对转化选择抗生素敏感的再生系统。,一、遗传转化对园艺植物受体系统的要求高效稳定的再生能力(2)较高的遗传稳定性(3)稳定的外植体来源,(4)对抗生素的敏感性 1）选择性抗生素：在遗传转化中用于筛选转化体，如卡那霉素、潮霉素2）抑菌性抗生素：在受体材料与农杆菌共培养一定时间后用于抑制农杆菌的生长，防止细菌过度生长而产生污染。这类抗生素要求对植物细胞无毒害作用或毒害作用较小，不影响植物细胞的正常生长，如氨苄青霉素、羧苄青霉素、头孢
3、霉素等,(5)对农杆菌侵染的敏感性 在选择农杆菌转化系统前必须测试受体系统对农杆菌的敏感性，只有农杆菌侵染敏感的植物才能作为受体系统 农杆菌敏感性试验的原理是利用野生型农杆菌能在外植体组织中形成肿瘤或发根，根据肿瘤的诱导率、发生时间及生长状态判断其敏感程度。其操作程序是把常用的菌株接种在固体琼脂平板或液体培养基中，用牙签挑取菌体，穿刺受体植物组织。可在同一植株的不同部位叶片及其中脉、花、茎和幼茎的节间多次接种，比较其敏感性。然后将植株在光照几周后观察肿瘤或发根的诱发情况，能形成肿瘤或发根，则说明该植物材料可作为农杆菌的一个宿主，可用农杆菌介导转化。,二、常用的园艺植物受体系统 1、组织受体系统
4、2、原生质体受体系统3、生殖细胞受体系统,（1）组织受体系统 定义：利用园艺植物的叶片、幼茎、子叶、胚轴等外植体培养获得再生植株的受体系统为组织受体系统。,矮牵牛茎尖,花烛叶片离体快速繁殖,优点：转化率高、外植体来源容易、转化植株易扩繁、适用广泛等；缺点：外源基因遗传稳定性差、嵌合体多,a）愈伤组织再生系统：指外植体经过脱分化形成愈伤组织，再分化获得再生植株,b）直接分化再生系统：不经过愈伤组织阶段，直接分化出不定芽获得再生植株优点：操作简单、体细胞无性系变异小等缺点：转化率低、嵌合体多,（2）原生质体受体系统,（3）生殖细胞受体系统 定义：利用植物自身的生殖过程，以生殖细胞如花粉粒、卵细胞为
5、受体细胞进行基因转化的系统称为生殖细胞受体系统，也称为种质系统。,利用生殖细胞进行遗传转化，主要有两种途径：1）利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养，诱导出胚性细胞或愈伤组织细胞，进一步分化发育成单倍体植株，从而建立单倍体的基因转化受体系统。,利用生殖细胞进行遗传转化，主要有两种途径：2）直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法、花粉粒浸泡法、子房注射法等。,与其他受体系统相比生殖受体系统具有以下优点：1）以具有全能性的生殖细胞直接为受体细胞，具有更强的接受外源DNA的潜能2）受体细胞是单倍体细胞，转化的细胞无显隐性的影响，能是基因充分表达，有利于性状的选育。单倍体植
6、株通过加倍后即可成为纯和的二倍体纯系，大大缩短了复杂的选育纯化的过程3）利用植物自身的授粉过程进行遗传转化，操作方便、简单。局限性：生殖受体系统受季节限制，只能在短暂的开花期进行。,第二节 园艺植物遗传转化方法,1）外源裸露基因的直接导入法：物理方法：电穿孔转化法、基因枪转化法、激光微束空孔转化法、体内注射法、超声波法等；化学方法：PEG和脂质体介导转化法等；2）载体介导的转化法：指通过将目的基因连接在植物载体上，随着载体DNA的转移而将外源目的基因整合到植物基因中的方法。该方法主要包括农杆菌介导和病毒介导的转化法3）种质转化系统法，包括植物原位真空渗入法和花粉管通道法等。,一、外源裸露DNA
7、的转化（一）化学诱导转化法 化学诱导DNA直接转化是以原生质体为受体，借助于特定的化学物质诱导DNA直接导入植物细胞的方法。目前用于转化细胞的化学物质有聚乙二醇（PEG）、聚鸟氨酸、聚乙烯醇等，其中最常用的化学物质是PEG。,1、转化原理转化原理：PEG不仅可以使细胞膜之间或使DNA与膜形成分子桥，促成相互间的接触和粘连，而且可以改变细胞膜的表面电荷，干扰细胞间的作用，从而改变细胞膜的通透性，诱导原生质体摄取外源基因DNA。,干扰因素：PEG浓度、分子大小、二价阳离子、溶液pH大小 在二价阳离子如磷酸钙的公共作用下，PEG能使外源DNA沉积在原生质体膜表面，并促进细胞对沉积的DNA进行主动吸收
8、，从而加快实现外源DNA进入受体细胞；高pH也可诱导外源DNA分子的吸收，因而PEG介导转化时常将溶液pH调到8.0左右。,2、转化的基本步骤及其应用PEG介导的遗传转化一般包含以下步骤：a）外源目的基因的制备b）原生质体制备c）目的基因和原生质体的转化培养d）转化体的鉴定和再生植物的培养目前PEG介导的遗传转化法在花椰菜、胡萝卜、向日葵、卡特兰、柑橘等园艺植物上均有成功的报道。,3、优缺点1）优点：a）操纵简单、成本低，无需昂贵的仪器设备；b）可同时操作多个样品，获得高存活率和分化率的转化细胞；c）DNA直接导入可用于对基因的瞬时表达进行快速分析；克服了农杆菌介导转化对受体植物范围的限制；d
9、）建立了原生质体再生体系的植物和组织都可适用，其结果比较稳定，重复性好。,2）缺点：转化率低，一般为10-510-3。,（二）电穿孔转化法 电穿孔转化法，又称电击法或“电注射法”。Fromm等首次使用该法成功将氯霉素乙酰转移酶cat基因导入玉米原生质体。,1、转化原理1）原理：利用高压电脉冲作用，在植物细胞膜或原生质体上造成非对称穿孔，形成瞬间通道，这种通道孔径在8.4nm左右，每个细胞膜上有上百个，因此能允许外源基因的进入；2）电穿孔法分为两类：高压短时程法可以得到较高的DNA整合率 低压长时程法可以使其达到较快的修复，从而得到较多的瞬时表达产物,2、操作程序及其应用电穿孔法一般操作程序：1
10、）制备含目的基因的质粒DNA2）制备植物原生质体悬浮液或一定处理的植物组织3）将质粒DNA和原生质体悬浮液混合后置于200600V/cm的电场中处理若干秒4）原生质体培养和转化子筛选5）再生植物鉴定与培养,3、优缺点1）电穿孔法的优点：操作简便、转化率较高2）电穿孔法的缺点：必须经过原生质体培养、易造成原生质体损伤，使其再生率降低,（三）基因枪转化法 基因枪转化法又称微弹轰击法，是植物遗传转化较常用的方法之一，转化率较高，一般为10-310-2，但不同物种组织转化率差异很大，最高的可达2.0%，最差的低于10-4。1、转化原理 基因枪法是利用火药爆炸、高压气体和高压放电作为驱动力，将包裹有生物
11、活性DNA的金属小颗粒加速，高速轰击植物组织或细胞，使外源基因实现穿壁并导入受体细胞中，然后通过细胞和组织培养技术，再生出新的植物类型的技术。,2、基本步骤及其应用基因枪遗传转化的基本步骤包括：1）受体细胞或组织的准备和预处理2）DNA微弹的制备3）受体材料的轰击4）轰击后外植体的培养和筛选目前，基因枪法分别在桃、番木瓜、蔓越橘、玫瑰、杜鹃、剑兰、大蒜、生菜、荔枝等园艺植物上成功实现了目的基因的转化,基因枪,3、优缺点基因枪转化法具有下列优点：1）无宿主限制2）操作简单，可控程度高，可以根据实验的需要调控微弹的速度和摄入浓度，命中特定层次的细胞，提高遗传转化效率；3）靶受体类型广泛不受基因型的
12、限制，能转化所有具有分生潜力的植物的任何组织或细胞，包括原生质体、根、叶以及种子的胚、子叶、分生组织、愈伤组织、花粉、子房等,4）可将外源基因导入线粒体、叶绿体等植物细胞的细胞器，重复性好，获得外源基因能稳定表达的转基因株系，这是目前质体转化研究中最常用和最有效的DNA导入方法。基因枪转化法的局限性：1）相对于农杆菌介导的遗传转化相比，基因枪转化法因轰击的随机性导致转化的效率较低2）成本高,3）出现非转化体和嵌合体的比率大；4）基因插入往往是多拷贝随机整合到受体基因组中，导致转录或转录后水平的基因沉默，因而遗传稳定性差；5）轰击过程中可能造成外源基因的断裂，使插入的基因成为无活性的片段等。,（
13、四）激光微束穿孔转化法1.转化原理 激光微束穿孔法又叫显微激光法，指将激光聚焦成微米级的微束照射细胞或组织后，利用其热损伤效应时使细胞壁上产生可逆性的小孔，使加入到细胞培养基里的外源基因进入植物细胞，从而实现基因的转化。,2.基本步骤及其应用激光微束穿孔转化法基本步骤如下：1）含目的基因质粒DNA的制备；2）植物外植体材料的选取及高渗预处理3）预处理外植体和质粒DNA混合并注入小室，然后用激光微束仪照射，照射时使用波长为0.35m，脉宽1015ns，输出能量大于2mJ，60008000脉冲；4）转化子筛选、培养及转基因植株鉴定。,3、优缺点优点：激光微束穿孔转化法具有操作简单、适用性广、无宿主
14、范围限制、能转化细胞器等特点缺点：所需仪器昂贵，转化效率较低 激光微束穿孔转化法最早用于大田作物，如水稻、小麦、玉米、油菜、棉花等，现已成功地应用于百脉根、马铃薯、兰花等园艺植物的遗传转化。,（五）体内注射转化法1.转化原理 体内注射转化法利用一定的注射器将外源基因直接注入到已固定的植物细胞或组织中，从而实现基因转移、获得转基因再生植株的技术，包括显微注射法和直接注射法。,2、基本步骤及其应用体内注射的基本操作步骤：1）制备具有良好表达活性的目的基因；2）受体细胞或组织的固定；3）通过体内注射导入已规定的受体细胞或组织；4）转化子筛选、培养及转基因植株鉴定显微注射的一个重要环节是固定受体细胞。
15、目前，人工固定的方法主要有3种：琼脂糖包埋法、多聚-L-赖氨酸黏连法、吸管支持法。,3、优缺点体内注射法的优点：1）可控制DNA注射量，并可对多种组织（如小孢子、胚前合子等）进行注射；2）转化率较高，整个操作过程对受体细胞无毒害作用，有利于转化细胞的生长发育。,体内注射的局限性：1）每次只能对一个细胞或组织进行操作，因而操作繁琐耗时，工作效率低；2）注射时可能刺伤受体细胞；3）外源DNA整合多为多拷贝，易引起整合部位的突变4）此种方法需以精细的显微操作技术和细胞低密度培养为基础，并且必须建立固定植物细胞或原生质体的技术，否则很难获得稳定表达的细胞克隆及转基因植株。,（六）脂质体介导转化法1.转
16、化原理 脂质体法是根据生物膜的结构和功能特性，人工用脂类如磷脂等化合物合成的双层膜囊包装外源DNA分子或RNA分子，导入原生质体或细胞，以实现遗传转化的技术,2.基本步骤及其应用脂质体法有两种具体方法：1）脂质体融合法：先将脂质体与原生质体共培养，使脂质体与原生质体膜融合，而后通过细胞的内吞作用把脂质体内的外源DNA或RNA分子高效地转入植物的原生质体内。最后通过原生质体培养技术，再生新的植株；2）脂质体注射法：通过显微注射把含有遗传物质的脂质体注射到植物细胞以获得转化。,3.优缺点脂质体法的优点：1）保护DNA在导入细胞之前免受核酸酶的降解作用，降低了对细胞的毒性效应2）适用的植物种类广泛，
17、重复性高，操作简单，转化率较高。脂质体法的缺点：脂质体转化率低，需要完善的原生质体培养及植株再生技术体系支持,（一）根癌农杆菌介导的遗传转化1.转化原理 根癌农杆菌在自然条件下感染大多数双子叶植物的受伤部位，诱导植物产生冠瘿瘤并合成冠瘿碱，为其生长发育和繁殖提供碳源、氮源和能源，干扰被侵染植物的生长。根癌农杆菌细胞中的Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，相对分子质量为9.51071.6108。,二、载体介导的DNA转化,根癌农杆菌侵染植物后产生冠瘿瘤,根癌农杆菌侵染植物后产生冠瘿瘤,2）Vir区：该区段上的基因能激活T-DNA转移3）Con区：该区段上存在着与细菌间结合转移相关的基因（tr
18、a），调控Ti质粒在农杆菌之间的转移。冠瘿碱能激活tra基因，诱导Ti质粒转移，因此称之为结合转移编码区。4）Ori区：该区段基因调控Ti质粒的自我复制起始，故称为复制起始区（点）。,Ti质粒4个功能区域：,1）T-DNA区（transferred DNA region，转移-DNA区）长度为1530kb，是根癌农杆菌侵染植物细胞时从Ti质粒上切割下来转移并整合到植物基因组中的一段DNA。,根癌农杆菌Ti质粒遗传转化大致可以分为以下步骤：1）农杆菌识别并附着到植物细胞上2）植物信号分子被农杆菌Ti质粒上的由VirA/VirG组成的双组分信号转导系统所识别；3）经过信号转导诱导Ti质粒上Vir区
19、基因的表达；4）VirD1和VirD2蛋白共同作用，切割T-DNA的左右边界，产生一条单链T-DNA分子（T链）；5）在农杆菌细胞中，1分子VirD2蛋白共价结合到T链的5端，形成ssDNA-蛋白复合体（未成熟T复合体），然后和几个别的Vir蛋白一起，通过VirB/D4 型分泌系统（T4SS通道）进入植物细胞的细胞质,6）此时，未成熟T复合体受到许多VirE2分子的包裹和保护，形成成熟的T复合体，并通过植物细胞的细胞质向细胞核运输；7）在VirD2和E2蛋白的核定位信号识别下，成熟T-DNA复合体通过细胞核核孔进入植物细胞细胞核；8）T复合体在细胞核内被运输到整合位点；9）T-DNA解包裹；1
20、0）T-DNA整合到植物基因组中。,根癌农杆菌Ti质粒遗传转化步骤,2.基本步骤及其应用农杆菌Ti质粒介导的植物基因转化方法有：叶盘转化法、原生质体共培养转化法、整株感染法等以上转化方法的基本程序包括：a）含重组Ti质粒的工程菌培养及转化；b）选择合适的外植体；c）工程菌与外植体共培养；d）外植体脱菌及筛选培养；e）转化植株再生及鉴定。,3.优缺点优点：1）利用天然载体系统，成功率高，效果好；2）转移的外源基因常为单拷贝整合，很少发生甲基化和转基因沉默，遗传稳定，而且符合孟德尔遗传定律；3）费用低，方法简单，易于操作；4）与基因枪法结合使用，效果更佳；5）使用寄主范围广，几乎所有的双子叶植物都
21、可采用此法。,缺点：1）农杆菌介导的转化主要应用于双子叶植物和少数单子叶植物，大多数单子叶植物，尤其是禾本科作物对农杆菌不敏感，限制了它的应用范围；2）农杆菌侵染后的外植体再生阶段脱菌比较困难，需要长期使用抗生素，给实验带来麻烦。,（二）发根农杆菌介导的遗传转化 Ri质粒是发根农杆菌染色体外的遗传物质，与Ti质粒相似，属于巨大质粒，大小为200800kb。Ri质粒与Ti质粒不仅结构、特点相似，而且具有相同的寄主范围和相似的转化原理。,产生毛状根,三、种质转化法 定义：以植物自身种质细胞为媒介，将外源DNA导入完整植物细胞，实现遗传转化的技术称为种质转化系统，该技术也称为生物媒体转化系统或整株活
22、体转化。,种质转化法具有的特点：1）目的DNA可以是裸露的DNA，也可以是总DNA或重组质粒DNA，还可以是某些DNA片段；2）转化过程依靠植物自身的种质系统或细胞结构来实现，不需要细胞分离、组织培养和再生植株等复杂技术；3）方法简便易行，并与常规育种紧密结合,（一）植物原位真空渗入法1.转化原理 原理：将适宜转化的健壮植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理、造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下发生遗传转化。,2.基本步骤及其应用植物原位真空渗入法的基本步骤：1）培养生长到一定阶段的植物，一般是开始现蕾至开花初期；2）制备含目的基因的农杆菌菌液；3）
23、将植物倒置浸泡于农杆菌菌液中，进行真空处理；4）感染植物种植于土壤中，生长发育，直到收获种子；5）种子在选择培养基上发芽，进行抗性筛选，获得转化后代。,3.优缺点植物原位真空渗入法的优点：简便、快捷，实验可靠、成本廉价，不需要进过组织培养阶段即可获得大量转化植株，转化率高；植物原位真空渗入法的缺点：在遗传转化时需要真空装置，真空处理前后植株的拔取和重新栽培增加了工作量；应用范围较窄，需要进一步的开发。,（二）花粉管通道转化法 定义：花粉管通道转化法是一种借助于植物自身的生殖卵细胞或受精卵为转化对象的直接转化技术。1.转化原理 在植物授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在开花、受精过
24、程中形成的花粉管通道，将外源DNA导入受精卵细胞，并进一步地被整合到受体细胞的基因组中，随着受精卵的发育而获得转化植株。,2.基本步骤及其应用基本程序包括：1）外源DNA的制备；2）根据受体植物受精过程及时间，确定导入外源DNA的时间及方法；3）将外源DNA导入受体植物；4）转基因植物目标性状的鉴定及分子检测。利用花粉管通道法导入外源基因的方法通常为：花粉粒与外源DNA混合授粉法、花粉粒培养法、柱头滴柱法、花粉粒转化法和微注射法等。,3.优缺点优点：1）不依赖于细胞、原生质体等组织培养和诱导再生植株等过程，技术简单，不需要装备精良的实验室，常规育种工作者易于掌握，成本低，适宜普及；2）适用于多
25、种单、双子叶植物局限性：1）该种方法只能在开花期才能进行，而且受体植物的受精过程及时间规律难以掌握；2）重复性差、成株转化率相对低,（三）种子浸泡转化法定义：浸泡转化法指将供试外植体如种子、胚、胚珠、子房、幼穗甚至幼苗等直接浸泡在外源DNA溶液中，利用渗透作用可将外源基因导入受体细胞并得到整合与表达的一种转化方法。,1.转化原理 浸泡转化是利用细胞自身的物质运转系统将外源DNA直接导入受体细胞。将外源DNA吸入植物细胞的途径有：1）通过细胞间隙与胞间连丝组成的网络化运输系统可以将外源DNA运输到每个细胞；2）通过内吞作用将外源DNA摄入细胞内；3）通过传递细胞的膜透性的改变为大分子物质透过细胞
26、提供机会,2.基本步骤及其应用浸泡转化法的基本步骤：1）外源DNA的制备；2）具有生活能力种子的获得及浸泡处理；3）在浸泡液中加入外源DNA；4）种子培养、发芽及抗性鉴定。,3.优缺点优点：种子浸泡转化法是植物转基因技术中最简单、快捷、便宜的一种转化方法，不需要昂贵的仪器设备和复杂的组织培养技术，可以进行大批量的受体转化工作，并且容易推广普及；局限性：转化率低，重复性差,第三节 园艺植物转化植株的鉴定,外源基因整合检测方法为：Southern杂交、PCR、PCR-Southern杂交、原位杂交、DNA分子标记技术等表达水平的检测方法为：Nourthern杂交、RT-PCR、酶联免疫吸收法（EL
27、ISA）、Western较等,一、利用选择标记基因和报告基因鉴定定义：选择标记基因是指在选择压下，编码产物能够使转化细胞、组织具有对抗生素或除草剂的抗性，而非转化细胞则不能在施用选择剂的条件下生长、发育和分化的基因。选用选择标记基因有利于在大量的细胞或组织中筛选出转化细胞及植株。,植物基因工程中选择标记基因一般具有4个特征：1）编码一种不存在于正常植物细胞中的产物，如酶和蛋白质；2）基因较小，易构成嵌合基因；3）能在转化体中得到充分的表达；4）容易检测并能定量分析。报告基因是指其编码产物在受体细胞、组织或器官中具有表达活性，能够被快速地测定的一类特殊用途的基因。,（一）抗生素抗性基因鉴定园艺植
28、物遗传转化上常用的抗生素抗性基因有新霉素磷酸转移酶基因（npt）和潮霉素磷酸转移酶基因（hpt）。1）npt是卡那霉素抗性基因或氨基葡萄糖苷磷酸转移酶基因，是园艺植物转化中运用最广泛的选择标记基因，其编码产物对卡那霉素、庆大霉素的那个具有抗性。卡那霉素能干扰一般植物细胞叶绿体及线粒体蛋白质的合成，会导致植物细胞死亡。常用浓度为50100g/mL。,2）hpt基因的表达产物对潮霉素具有抗性，因而在培养基中筛选的抗生素是潮霉素，常用浓度为30100 g/mL,（二）除草剂抗性基因鉴定 植物遗传转化中常使用的除草剂抗性基因有bar、aroA、als和PSbA，其中bar和als最为常用。Bar是编码
29、膦丝菌素乙酰转移酶（PAT）基因，该酶能使除草剂Basta（有效成分PPT）失活，从而达到除草剂的目的。,（三）显色或发光基因鉴定作为理想的植物报告基因应具备以下特征：1）编码的产物是唯一的，并且对受体细胞无毒；2）表达产物及产物的类似功能在未转化的细胞内不存在，即无背景；3）产物表达水平稳定，便于检测等。转基因植物常用的报告基因有-葡萄糖醛酸乙酰转移酶基因（gus）、胭脂碱合成酶基因（nos）、章鱼碱合成酶基因（ocs）、荧光素酶基因（luc）和绿光荧光蛋白基（GFP）基因,1.gus基因的鉴定 来自大肠杆菌的gus基因是应用较为广泛的报告基因，编码-葡萄糖醛酸乙酰转移酶，能作用于底物产生蓝
30、色沉淀，该反应可用于分光光度法测定，而蓝色沉淀沉积于植物的组织又可直接观察到，因而gus基因表达检测容易、迅速，只需少量的植物组织即可在短时间内测定完成。,2.nos和ocs基因的检测目前采用纸电泳法检测nos和ocs基因。电泳后用菲醌染色，菲醌与精氨酸、胭脂碱、章鱼碱作用后在紫外光下显示黄色荧光，放置两天后变为蓝色。3.荧光素酶基因的鉴定荧光素酶基因主要来自于细菌和萤火虫。细菌荧光素酶以脂肪醛为底物，催化脂肪醛氧化为脂肪酸，同时放出光子；萤火虫荧光素酶在镁离子、三磷酸腺苷和氧的作用下，与底物作用生成氧化荧光素，同时放出光子，便于检测。,4.绿色荧光蛋白（GFP）基因的鉴定,二、利用重组DNA
31、分子特征鉴定（一）重组DNA分子酶切图谱鉴定 目的基因插入会使表达载体DNA限制性酶切图谱发生变化，提取转化细菌的质粒，DNA酶切后做电泳观察其酶切图谱，即可分析外源基因是否正确插入载体中。,（二）PCR技术鉴定,（三）Southern杂交技术鉴定,三、利用外源基因的转录或表达鉴定（一）Northern杂交与点杂交技术鉴定,（二）Western杂交技术鉴定,（三）蛋白质免疫测定技术鉴定1.酶联免疫法酶联免疫法（ELISA）指特殊的抗体被结合固定在固体表面如微孔上，加入样品，未被结合的成分被洗掉，然后通过加上酶的抗体来检测抗原，未被结合的成分再次被洗掉，酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比
32、。在转基因植株中，含有抗体的均可采用此方法进行。2.免疫荧光技术免疫荧光，是以抗体为基础，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，所发出的荧光可由免疫荧光显微镜进行检测。,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,一、转基因园艺植物中外源基因的沉默（一）转基因沉默现象定义：园艺植物遗传转化的目的是获得能高效表达、稳定遗传的转基因株系，但大量的实验表明，导入并整合进受体基因组中的外源基因在转化体的当代或其后代中出现表达受到抑制，甚至完全不表达的现象，称为转基因沉默。转基因沉默分为：转录水平上的基因沉默（TGS）转录后水平上的基因沉默（PTGS）.,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略
33、,(二)引发转基因沉默的因素1.DNA甲基化,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,2.重复序列定义：重复序列诱导的基因沉默（RIGS）指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。重复序列有两种作用方式：1）顺式失活，指相互串联或紧密连锁的重复基因失活；2）反式失活，指由于基因启动子间同源序列相互作用引发的基因失活现象，也指某一基因的失活状态引起同源的等位或非等位基因的失活。,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,3.位置效应定义：位置效应是指外源基因在植物基因组中的插入位置对其表达的影响。4.共抑制现象定义：共抑制现象指外
34、源基因的导入不但使外源基因不能高效表达，还会抑制与其同源的內源基因的表达。共抑制最早是在转苯基苯乙烯酮合成酶（CSH）的矮牵牛中发现的。目前，在真菌、动物中均发现类似的现象分别称为抑制、RNA干扰（RNAi）。共抑制现象属于转录后水平的基因沉默（PTGS）。,第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略,5.反义RNA,二、提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略（一）采用合适的转化方法园艺植物外源基因的转化方法很多，不同转化方法对外源基因的表达水平影响不同。常用的有农杆菌介导法和基因枪法等。基因枪法导入的外源基因为多拷贝，而农杆菌介导法能够减少导入外源基因的拷贝数，减少多拷贝植株的数量，
35、并且已经可以实现外源基因的单拷贝，从而避免重复序列产生的基因沉默现象。,（二）使用信号肽外源基因在植物组织细胞中表达时，其表达产物受细胞中大量蛋白酶的作用而降解，造成外源蛋白积累量的减少。因此，采取措施保护外源蛋白不受降解是实现转基因成功的重要一环。（三）使用强启动子和诱导型启动子启动子是决定外源基因转录效率的关键因素，在构建外源基因载体时，选择强启动子和诱导型启动子可以增加转录活性，是基因转录产物增加。,诱导型启动子可分为3种类型：1）A型启动子可以被生长素、脱落酸等植物生长物质及创伤诱发所产生的系统素所诱导；2）B型有高温、低温、高盐、重金属等环境因子诱导；3）C型是指能够对人工合成的化学
36、诱导物，如四环素、苯并噻二唑等发生反应的启动子。目前，利用这些启动子获得的转基因植株能应用于生产的还较少，但也有少量成功的报道。而组织或器官特异性表达的启动子则应用的相对较多。,（四）使用终止子终止子虽然不具有增强子的功能，但不同来源的植物基因终止子对外源基因的表达有着很大的影响。（五）使用增强子利用具有组织与发育特异性调控作用的增强子构建嵌合基因，是提高外源基因表达效果的有效措施之一。（六）使用植物偏爱的密码子植物基因具有自己特有的AT/GC碱基偏爱性，即密码子偏爱性。在体外，应用DNA重组技术对外源基因做修饰改造，使其改造成植物偏爱的密码子是十分必要的。,（七）使用基质结合区序列 基质结合
37、区（MAR）又称核骨架结合序列（SAR），是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异性结合的DNA序列，大小为3002000bp，富含AT和保守结构区域。研究发现，MAR是一种新的顺式作用元件，将其置于所转基因的两侧，构建成MAR-gene-MAR，可以创造一个独立的结构域。这样可克服基因组对外来基因的识别和抑制，并阻隔了周围染色质顺式调控元件的影响，减少位置效应，显著提高转基因的表达水平。,（九）改造外源基因 基因结构组成5端序列、poly（A）信号和内含子等对转化外源基因的表达具有调控作用。研究发现，真核生物mRNA起始密码子前约100bp的非转译序列是其正常转译所必须的，且这段RNA的碱
38、基组成对转译活性有重要影响。,（八）防止甲基化,第五节 基因沉默技术与基因剔除技术,一、基因沉默技术（一）病毒介导的基因沉默技术定义：病毒诱导的基因沉默（VIGS）是一种通过抑制基因转录水平研究植物基因功能的方法。VIGS技术技术应用最成功的植物是本生烟草。烟草脆裂病病毒（TRV）已经被用于在烟草中进行大规模高通量的基因功能研究。,VIGS技术的具体内容：1.原理：VIGS是利用植物体内天然存在的免疫机制，将目的基因片段构建到病毒载体中并用病毒侵染寄主植物，目的基因片段作为病毒的一部分同病毒一起复制并扩散到植株植物，植物体的防御机制被病毒激活后，在识别病毒和目的基因的同时，将內源的目的基因mR
39、NA降解，从而达到基因沉默的目的，属于一种转录后基因沉默现象。,2.基本操作步骤VIGS技术的基本操作步骤：1）克隆靶基因；2）构建含靶基因核心序列的病毒遗传载体；3）将病毒载体转化农杆菌，并用转化的农杆菌，以真空渗透或注射渗透的方式感染幼嫩植株；4）筛选目的表型突变体。,3.优缺点VIGS技术的优点：1）仅用一个蜘蛛就能鉴定一个表型；2）结果可被迅速放大和重复；3）产生目的表型的基因序列可迅速通过检测VIGS载体来鉴定；4）是一个转染过程，不需要遗传转化过程，所需时间短；5）在植株幼苗期感染，可获得发育相关基因沉默的表型突变体；6）可克服基因家族功能冗余的缺点；7）可迅速比较不同物种之间的基
40、因功能,VIGS技术的局限性：1）很难得到完全抑制靶基因表达的结果，降低的转录水平仍然可以产生足够的功能蛋白，很可能遗漏沉默表型不明显的植株；2）沉默水平因不同的植株和不同的实验有所差异；3）沉默效率依赖病原体与宿主之间的关系，病毒感染植株可能会改变植株的发育尤其是株高以及叶片形态；4）沉默的微弱表型被病毒自身引起的表型所掩盖会遗漏一些目的植株。,（二）RNAi技术,二、基因剔除技术定义：基因剔除，又称基因打靶技术，是利用同源重组、点突变或随机突变、RNAi等途径使机体已知结构的特定基因失活或缺失的技术，是一种新型分子生物学技术。,（一）利用同源重组进行基因剔除技术1、原理 应用DNA同源重组
41、原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因剔除的目的。利用同源重组进行基因剔除主要分为条件性基因剔除和诱导性基因剔除，两者都利用Cre/Loxp系统为基础实现基因剔除，前者靶基因的修饰以Cre表达为前提，而后者利用的是Cre启动子诱导或酶活性控制来实现的。,（二）利用随机插入突变进行基因剔除技术1.原理 利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通过相应的标记进行筛选获得相应的基因剔除细胞。目前，植物中常用的随机插入突变可分为农杆菌介导的T-DNA插入突变和转座子插入突变（Ac/Ds、En/Spm转座
42、系统）,第六节 外源基因在园艺植物中的遗传,外源基因在转基因植物中的遗传方式：1）转化的外源基因多数表现为单基因显性的孟德尔式分离，单位点插入不论是单拷贝还是多拷贝串联，多数转基因植株能稳定显示孟德尔单基因分离规律；Ko等研究外源基因hpt在辣椒转化植株中的遗传转化规律发现：a）hpt基因已经在转基因辣椒（T0）成功表达；b）hpt基因没有任何修饰的传递给子代（T1）；c）转基因植株自花授粉产生T1代对潮霉素抗性出现3:1分离。,2）完整或部分转基因多拷贝插入主要以孟德尔双基因或多基因性状遗传；3）转基因后代分离也发现10%50%的非孟德尔分离现象；总结导致非孟德尔遗传现象的可能原因如下：a）受体植物基因组特性，如遗传背景不稳定、配子体生存能力限制、染色体异常、转化方法等；b）外源基因的特性，如转基因沉默现象、外源基因不稳定整合；c）植物基因组与外源基因的相互作用，如同质致死、外源基因传递不足、减数分裂交叉或有丝分裂不稳定等。,外源基因在植物中的应用,外源基因在植物中的应用,Bt transformed cotton,untransformed cotton,外源基因在植物中的应用,外源基因在植物中的应用,转基因技术新物种蓝色玫瑰,谢谢！20130428,
