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1、第13章 基因工程与基因组学概述,第一节 基因工程,一、基因工程概述二、基因工程工具酶三、基因工程的流程及相关技术四、基因工程的发展应用,一、基因工程概述,遗传工程（genetic engineering），也称生物工程，利用工程技术的方法改造和修饰生物体，使其产生新的性状或产品，从而改良生物体的一种遗传学手段。核心是利用重组DNA技术，在分子水平上操作修饰改变生物体遗传结构。基因工程（gene engineering）：利用人工的方法把生物的遗传物质在体外进行切割、拼接和重组，获得重组DNA分子，然后导入宿主细胞或个体，使受体的遗传特性得到修饰或改变的过程。,二、基因工程的工具酶,内切核酸酶
2、(endonuclease)DNA连接酶(ligase)DNA聚合酶（DNA polymerase）RNA聚合酶（RNA polymerase）反转录酶（reverse transcriptase）最重要的工具酶是限制性核酸内切酶（restriction endonuclease），也称限制性酶(restriction enzyme),能识别双链DNA分子中一段特异的核苷酸序列，并在特定的位置将双连DNA分子切断。,Eco R 属名 种名 菌株名 序号,（一）限制性核酸内切酶,常见内切酶,（二）DNA连接酶,连接5磷酸和3OH，形成磷酸二酯键，封闭DNA双链上的缺刻。如：Ecoli DNA连接
3、酶 T4 DNA连接酶,载体(vector),将外源DNA片段运送进宿主细胞(host cell)进行扩增或表达的运载工具称为载体。载体也是DNA分子。常用的载体有细菌质粒、噬菌体、病毒等。经改造的黏粒(cosmid)、噬粒(phagemid)都要经过人工改造。细菌人工染色体（BAC）、酵母菌人工染色体（YAC）和人类人工染色体（HAC）,噬菌体载体,YAC（1Mb）,载体的基本条件,有独立的复制原点(ori)，能独立地自我复制，而且能带动外源DNA一起复制。具有多种限制性酶的切点，用于连接外源DNA 片段。载体上的限制酶酶切位点对于任何一种限制酶来说只能有一个。具有一个选择标记基因。,获得外
4、源DNA片段（分）限制性内切酶切割外源DNA片段与载体（切）外源DNA片段与载体连接（接）重组DNA分子转入宿主细胞（转）重组子的筛选与鉴定（筛）目的基因的确认与分析,三、基因工程的流程及相关技术,（一）外源DNA片段的分离方法,构建基因组文库分离法差别显示反转录PCR利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因,1.构建基因组文库分离法,用克隆载体将某种生物的基因组全部遗传信息储存于一个受体菌的群体，即构成了这种生物的基因组文库。若只储存某生物基因组的部分遗传信息，即构成部分基因组文库。供体生物的基因组DNA切割成许多片段将所有片段分别连接到载体上，构成一个重组DNA群体这个群体包含全基因组的遗传信息
5、。保存、筛选,差别显示分析基本流程,2.差别显示反转录PCR（DDRT-PCR）,3、利用聚合酶链式反应技术扩增目的基因,（1）套式PCR（2）反向PCR（3）不对称PCR（4）锚定PCR（5）长程PCR（6）反转录PCR,4、人工合成基因,根据已知的基因序列，或根据氨基酸序列推测DNA序列将化学合成寡核苷酸的方法与酶促合成DNA的方法结合起来，可以很快地人工合成基因。,通过用相同的限制性核酸内切酶切割，连接形成一个重组DNA分子,（二）、外源DNA片段与载体的切割和连接,（三）、重组DNA转入宿主细胞,1.重组DNA转入原核细胞 热激转化法 电穿孔转化法2.重组DNA转入真核细胞 农杆菌转化
6、法,重组DNA,感受态细胞,冰浴混合、静置,42C 热激,加入培养基,扩培,转化液涂含抗菌素的平板,吸附DNA,摄入DNA,（1）热激转化法,感受态细胞,电转仪调为2.5kV 25F,脉冲控制器200-400,质粒DNA,混合,加入培养液,37 中速震荡,涂板,（2）电穿孔转化法,2.重组DNA转入植物细胞,农杆菌介导的Ti质粒载体转化法,（四）重组子的筛选与鉴定,核酸杂交PCR检测测序生物学活性检测,1.插入抗性失活,2.蓝白斑筛选,1.抗性插入失活筛选法,蓝白斑筛选重组质粒,无插入片段的载体和受体菌-互补产生LacZ，IPTG诱导下，生色底物X-Gal产生蓝色菌落；当外源DNA插入到质粒的
7、多克隆位点后，导致不能-互补，使带有重组质粒的细菌形成白色菌落。,四、基因工程的发展应用,1、基因工程是生物科学基础研究的重要手段2、利用转基因技术改良植物已取得很大进展并在生产上应用3、利用基因工程获得大量重组的蛋白、疫苗药物4、利用基因工程进行不同物种之间的基因传递提供了可能。转基因动植物-“生物工厂”5、疾病诊断与基因治疗6、环境保护,4.利用基因工程改良动物,推荐几本参考书：1、基因工程原理与方法，孙树汉编，人民军医出版社2、基因工程原理，吴乃虎编，科学出版社（侧重原理）3、现代基因工程技术导论，陈章良编，科学出版社（侧重应用）4、分子克隆(第三版)，J.Sambrook et al.
8、科学出版社（具体的实验方法，分子生物学研究的圣经）,第二节 基因组学,一、基因组学概述二、基因组图谱的构建三、基因组图谱的应用四、后基因组学,基因组(genome)泛指一个有生命体、病毒或细胞器的全部遗传物质；在真核生物，基因组是指一套染色体（单倍体）DNA。,一、基因组学概念及范畴,基因组学(genomics)就是发展和应用DNA制图、测序新技术以及计算机程序，分析生命体（包括人类）全部基因组结构及功能。,基因组学研究的最终目标,获得生物体全部基因组序列鉴定所有基因的功能明确基因之间的相互作用关系阐明基因组的进化规律,基因组学研究内容 结构基因组学(structural genomics)功
9、能基因组学(functional genomics)比较基因组学(comparative genomics),结构基因组学（structural genomics）,基因定位 基因组作图 测定核苷酸序列,遗传图（连锁图）物理图转录图序列图,二、基因组图谱的构建,基因组计划的第一个环节：构建基因组图谱,1.遗传图,连锁图(linkage map)，采用遗传分析的方法将基因/DNA标定在染色体上。即指基因标记在染色体上的遗传距离，即确定各基因在基因组中的相对位置和排列顺序。遗传距离通常由基因在四分体时期染色体交换过程中分离的频率厘摩（cM）来表示。,遗传标记（Genetic marker）指可识别
10、的等位基因。它具有两个基本特征，即可遗传性和可识别性，因此生物的任何有差异表型的基因突变型均可作为遗传标记。类型：形态标记（morphological marker）细胞学标记(cytological marker)生化标记(biochemical marker)分子标记(molecular marker)构建遗传图谱就是寻找基因组不同位置上的特征性标记，标记必须有多态性，多态性则是突变的结果。,2.、物理图,以已知核苷酸序列的DNA片断（序列标签位点,STS）为“路标”，以碱基对作为基本测量单位（图距）的基因组图。用分子生物学的方法直接检测DNA标记在染色体上的实际位置 DNA上两点的实际距
11、离，即确定基因在染色体上的实际排列顺序，从而对基因定位。,限制酶作图依靠克隆的基因组作图荧光原位杂交序列标签位点作图,3、转录图,以EST（expressed sequence tag，表达序列标签）为标记，根据转录顺序的位置和距离绘制的图谱。,4.、序列图,序列图是指整个人类基因组的核苷酸序列图，也是最详尽的物理图，既包括可转录序列，也包括非转录序列，是转录序列、调节序列和功能未知序列的总和。这是人类基因组计划最繁重、耗时最多的工作。,测序策略：鸟枪法 克隆重叠群法,鸟枪法（shotgun sequencing）,克隆重叠群法（clone contig）,将基因组DNA切割长度为0.1Mb1
12、Mb的大片段，克隆到YAC或BAC载体上 然后再进行亚克隆，分别测定单个亚克隆的序列 再装配、连接成连续的DNA分子。这是一种自上而下（up to down）的测序策略 clone-by-clone method,CREDIT:JOE SUTLIFF,Science,Vol 291:1221.,Fishing in a More Effective Way!,钓鱼 竭泽而渔,人类基因组计划,1990，美国国立卫生研究所和能源部投资30亿，启动了人类基因组计划，预计15年时间完成人类基因组全部序列的测定1996，完成标记密度为0.6cM的人类基因组遗传图谱，100kb的物理图谱2000，完成草图
13、2001年2月，公布人类基因组图谱的修订版2002，完成测序工作,国际人类基因组测序协作组（公共计划组）由6个国家、20个研究中心的2000多位科学工作者组成。,1999年9月 中国获准加入人类基因组计划，负责测定人类基因组全部序列的1%，负责第3号染色体3千万核苷酸的序列测定工作。中国是继美、英、日、德、法之后第6个国际人类基因组计划参与者，也是参与这一计划的唯一发展中国家。,人类基因组计划1%测序中国实验室,2000年6月26日 科学家公布人类基因组工作草图，标志着人类在解读自身“生命之书”的路上迈出了重要一步。,HGP对人类基因面貌的新发现,基因数量少得惊人人类基因组中存在“热点”和大片
14、“荒漠”三分之一为“垃圾”DNA种族歧视毫无根据男性基因突变比例更高,2000年是基因组之年，完成了人类基因组的工作框架图，完成了一系列模式生物和微生物的基因组序列分析。,2000 年 12 月美、英等国科学家宣布绘出拟南芥基因组的完整图谱，这是人类首次全部破译出一种植物的基因序列。,三、后基因组学（postgenomics),完成一个生物体全部基因组测序后即进入功能基因组学阶段，也称后基因组阶段详尽分析序列，描述基因组所有基因的功能，包括研究基因的表达及其调控模式。基因的识别、鉴定、克隆 基因结构、功能及其相互关系 基因表达调控的研究,（一）鉴定DNA序列中的基因 ORF（二）同源搜索设计基因功能（三）实验性设计基因功能 clon,knock-out,knock-in,反义RNA,RNAi（四）描述基因表达模式,主要具体内容包括以下方面:,功能基因组学研究策略及主要内容,1、计算机预测基因功能-同源性比较（种间、种内）2、实验确认基因功能-基因克隆/基因敲除（knock-out）/基因的超表达/反义RNA技术/RNAi/转座子插入突变,
