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1、2023/8/11,1,多肽与蛋白质类药物,基 本 概 况,重组人干扰素生产工艺,胰岛素生产工艺,重组人红细胞生成素生产工艺,2023/8/11,2,概 述,多肽类药物研究简况,20 世纪 50年代 催产素；60年代 激素释放因子和释放激素抑制因子；70年代 脑肽、胃肠激素；80-90年代 脑-肠肽。,研究热点：（1）植物中发现和研究新的活性多肽，如中药麝香、人参。（2）多肽结构与功能的关系，便于制备更短的多肽。,2023/8/11,3,概 述,蛋白质类药物研究简况,蛋白质的研究是从 19 世纪中叶开始的，1839 年荷兰化学家马尔德(Mulder)首先使用“蛋白质”这个词。蛋白质是构成生物体
2、的一类最重要的有机含氮化合物，是塑造一切细胞和组织的基本材料，是生命的物质基础。各种不同的蛋白质，成分不同，其分子的立体结构、理化特性和生理生化功能等也各不相同。,近年来，随着各种新技术新方法（生物技术，分离纯化技术）的出现，对植物活性蛋白质以及细胞生长因子进行的研究和临床应用，蓖麻毒蛋白以及天花粉蛋白等；白细胞介素，红细胞生成素,集落刺激因子(CSF)及淋巴细胞活素等，最受瞩目的是肿瘤坏死因子和肝细胞生长因子。,2023/8/11,4,概 述,蛋白质类药物研究简况,有的科学家预言，对蛋白质类药物的研究、制造和应用，有可能在今后 10 年内使药物学出现革命性的变化和转折现已发现有 100 多种
3、蛋白质或细胞因子，这些是世界研究与开发新药的热点之一，有效地治疗疑难病症和变革传统医药工业，正吸引着人们去“开垦”，前景非常灿烂。,研究热点：（1）蛋白质结构改造，如对人生长激素加以化学修饰，疗效显著提高；（2）引进计算机及计算机图像技术研究蛋白质与受体及药物的相互作用，有可能设计出简单的小分子。,2023/8/11,5,概 述,分类和性质,1、多肽类药物 多肽类激素一般将50或50以下氨基酸残基组成的化合物，多肽在生物体内的浓度很低，但生理活性很强，在调节生理功能时起着非常重要的作用。常见腺体及其分泌物。分类:(1)多肽激素：垂体多肽激素、下丘脑激素、甲状腺激素、胰岛激素、胃肠道激素；（2）
4、多肽类细胞生长调节因子；（3）含有多肽成分的其他生化药物；,2023/8/11,6,概 述,分类和性质,1、蛋白质类药物 性质：酸碱性、离子结合、胶体性质、变性。分类：（1）蛋白质激素（2）血浆蛋白质（3）蛋白质类细胞生长调节因子（4）粘蛋白胃膜素等（5）胶原蛋白明胶、阿胶等 另有蛋白酶抑制剂、植物凝集素等,返 回,2023/8/11,7,胰岛素生产工艺,1、化学组成和性质,白色或类白色结晶粉末，全长1430bp。生理功能广泛，能促进糖原合成和糖酵解，产生ATP，降低血糖含量，保持能量供应。临床上应用于治疗糖尿病。1982年以前，人类应用全部是动物来源的胰岛素。1982年，生产重组人胰岛素获得
5、成功。其供应充分、消除动物胰岛中的病原体、经济适用。其制剂分为速效、中效和长效。,猪胰岛素原结构,2023/8/11,8,胰岛素生产工艺,1、化学组成和性质,可被胰岛素酶、胃蛋白酶、糜蛋白酶等水解，不能口服，只能注射。胰岛素pI为5.35.35，在pH4.56.5 范围内溶解度很低，室温下约10gm1；在锌盐存在下，胰岛素的pI可增至6.05，锌胰岛素制备一般在 pH5.86.3之间进行。,胰岛素制剂的研究动态,易溶于稀酸、稀碱；在80以下乙醇或丙酮中溶解；在弱酸性溶液中较稳定，pH24时更稳定。还原剂甲醛，硫化氢，硫代硫酸钠，VC，乙酐以及除金、银、钴、镍、锌以外的多数重金属均可破坏胰岛素的
6、活性。,2023/8/11,9,胰岛素生产工艺,2、生产工艺,（1）酸醇提取减压浓缩法,2023/8/11,10,胰岛素生产工艺,2、生产工艺,（1）酸醇提取减压浓缩法,提取 将冻胰用刨胰机刨碎后，加入2.32.6倍的8688乙醇和5草酸，搅拌提取3h,离心，滤渣再用1倍量68%70%乙醇和0.4草酸提取2h,合并提取液碱化、酸化 提取液在不断搅拌下加入浓氨水调pH，立即压滤，除去碱性蛋白质，滤液应澄清，并及时用硫酸酸化pH，静置 4 h 以上，使酸性蛋白充分沉淀。,减压浓缩 清液在30以下减压浓缩到原体积的l101/9)为止。去脂、盐析 浓缩液在去脂锅内，于5min内加热至50后，立即用冰盐
7、水降温至5，静置34h，分离出下层清液,调 pH22.5（单体状态），于2025在搅拌下加入27氯化钠，保温静置数小时，即得盐析物胰岛素粗品。,2023/8/11,11,胰岛素生产工艺,2、生产工艺,（1）酸醇提取减压浓缩法,除酸性蛋白 盐析物按干重计算，加蒸馏水和冷丙酮(7:3)，用4M氨水调，充分搅拌，低温放置过夜使溶液冷至5以下，低温下离心分离，或用过滤法将沉淀分离，得除酸性蛋白的滤液。锌沉淀 在滤液中加入4M氨水，使pH为，加入体积分数为3.6的乙酸锌溶液(20)，再调pH至6，低温放置过夜，过滤，收集沉淀，用冷丙酮洗涤，每千克得沉淀干品0.1-0.125克（无定形沉淀，聚合体）。,除
8、碱性蛋白 结晶加冰冷2枸橼酸50m1，6.5乙酸锌溶液2ml，丙酮16m1并用冰水稀释至100m1，充分溶解，冷到5以下，用氨水调pH8，速过滤，滤液用10枸橼酸溶液调pH6，结晶析出，在显微镜下观察，外形为似正方形或扁斜形六面体结晶。用蒸馏水或乙酸铵缓冲液洗涤，再用丙酮,乙醚脱水，离心，结晶置五氧化二磷真空干燥器中干燥，即得结晶胰岛素，效价25Umg以上，按新鲜猪胰计算总收率为1300U/kg。,2023/8/11,12,胰岛素生产工艺,2、生产工艺,（1）酸醇提取减压浓缩法,沉淀回收（包括除酸性和碱性蛋白、锌沉淀时的母液、无定型沉淀、油脂）制剂 胰岛素注射液配方：胰岛素400000U,(投
9、料按 41U毫升)甘油160g，苯酚20g，盐酸(10),注射用水加至 10000 毫升。用冷丙酮洗涤，每千克得沉淀干品0.1-0.125克。,2023/8/11,13,胰岛素生产工艺,2、生产工艺,（2）分级提取直接锌盐沉淀法,2023/8/11,14,胰岛素生产工艺,2、生产工艺,（3）重组DNA技术生产人胰岛素,胰岛素基因的获得 应用T4连接酶,把化学合成的具有彼此互补交叠的寡核苷酸片段,连接成双链的DNA,并按设计在这个合成基因的两端连接上2个限制酶识别位点，5端为EcoR 位点，3端为BamH 位点。,制备克隆载体pBR322的DNA,工程菌质粒的DNA（大肠杆菌表达系统）,工程菌发
10、酵，20%融合蛋白。包涵 体溶解（6M盐酸胍）,溴化氰切割、磺基化处理、氧化、纯化。,Eli Lilly公司工艺路线,融合基因,2023/8/11,15,胰岛素生产工艺,2、生产工艺,（3）重组DNA技术生产人胰岛素,溴化氰切割、磺基化处理、氧化、纯化。粗提：吸附、超滤和包涵体的洗涤；色谱分离：离子交换、分子筛和反相色谱；重结晶：,融合基因,2023/8/11,16,胰岛素生产工艺,3、胰岛素制剂及结构修饰,胰岛素制剂：按其作用时间分为速效、中效和长效；给药系统的不同分为眼用膜剂、鼻腔给药的气雾剂、直肠用栓剂、口服剂（脂质体、微囊、乳剂等）。,4、检验方法,晶型：白色结晶粉末；效价测定：家兔血
11、糖降低法和小鼠血糖降低法；纯度要求：主要控制分子量大的蛋白质和胰岛素原。,2023/8/11,17,胰岛素生产工艺,5、注解,(l)酸醇提取法原料质量是胰岛素生产的关键。胰的采摘、粉碎、存放等对收率影响很大。胰糜含水量约60，第1次提取用86乙醇，与胰糜混合后其最终体积分数为70左右，此体积分数不仅能完全溶解胰岛素，而且能抑制蛋白水解酶的活力。因此需要测定原料的含水量，调整乙醇的体积分数和用量。一般认为醇60一70最好，低于60溶出杂质较多、影响分离效果，高于80%，则胰岛素提取效率降低。草酸是弱酸，较温和，故提取时多采用草酸控制pH在 2.5，我国用硫酸和盐酸调节提取时的pH，获得较好效果，
12、便于综合利用胰渣。提取温度一般控制在1015，也有在室温下进行的对温度不加控制，温度偏高会增强酶对胰岛素的破坏作用，会使油脂含量增加，影响分离工序。,2023/8/11,18,胰岛素生产工艺,5、注解,碱化时pH一般为8.28.4最好，pH低了除碱性蛋白质不完全，且不易过滤，在碱性条件下胰岛素不稳定，其蛋白分解酶活力增加，因此，pH不能过高，操作尽快进行。酸性杂蛋白的等电点都在pH4.24.5左右，此时也能沉淀部分胰岛素,为减少胰岛素的损失，控制在pH3.6 3.8。浓缩能直接影响胰岛素的收率,国内用喷雾浓缩法，国外普遍用离心薄膜蒸发器，减少受热时间，提高收率。,浓缩除去乙醇后，油脂与水呈乳浊
13、液，采取速热速冷，先热后冷，可将乳浊液破坏分成两相，分离油脂，也可除去部分杂蛋白从油脂中回收胰岛素，用3氯化钠蒸馏水洗涤，有利油脂上浮，易于分离。制剂中的甘油是调整渗透压的，不宜用氯化钠，它会影响炽灼残渣结果苯酚作防腐剂，在pH3条件下抑菌作用强。对国内外胰岛素注射液进行聚丙烯酰胺圆盘电泳试验比较，发现国产注射液出现3-5条色带，丹麦Novo厂有4条色带，美国Lilly厂有3条色带，英国长靴厂有4条色带，说明我国胰岛素注射液的质量与国外产品相当。,2023/8/11,19,胰岛素生产工艺,5、注解,(2)直接锌盐沉淀法利用氯化锌与胰岛素直接形成锌胰岛素沉淀，省去了浓缩工序，与酸醇提取减压浓缩法
14、比较，可提高总收率近 50，但周期较长，产品纯度偏低。盐酸对胰岛素提取有利，但易使组织胶化，造成过滤困难，单用硫酸虽能克服胶化现象但提取量低，用量大，在加入氯化锌时则生成溶解度较小的硫酸锌，消耗锌离子。因此，采用两种酸结合使用的方法，先以硫酸酸化，后用盐酸维持其提取时的pH，效果较佳。用草酸酸化提取液时，碱化后生成在乙醇中难溶解的草酸铵，有助滤作用。改用硫酸和盐酸时，碱化后过滤困难，需要添加硅藻土作助滤剂。,2023/8/11,20,重组人红细胞生成素生产工艺,1、种类,红细胞生成素（erythropoietin，EPO）对红细胞生成的特异性刺激作用的细胞因子。红细胞生成素是一种糖蛋白，在胎儿
15、体内由肾脏及肝脏产生，而在成人体内主要由肾脏产生。红细胞生成素与靶细胞如骨髓细胞、脾细胞、胎儿肝细胞的特定位点结合，从而促进红细胞前体细胞的增殖、分化并成熟为红细胞，增加骨髓向循环血中释放红细胞。,天然红细胞生成素是以人或动物的尿、血等为原料，经生物化学方法纯化得到。目前已知人红细胞生成素有两种存在形式，即人EPO-及人EPO-，二者差别在于二者的糖型组成不同，EPO-含有较多的N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰神经氨酸，总的含糖量也较EPO-高。,重组人红细胞生成素，是以重组DNA技术生产的红细胞生成素，将红细胞生成素的基因连接到表达载体上，转化CHO细胞，从细胞培养上清液中纯化得到红细胞生成素。
16、重组人红细胞生成素与天然具有相同的体内、体外活性。,2023/8/11,21,重组人红细胞生成素生产工艺,2、临床应用,重组红细胞生成素(EPO)是目前临床上治疗慢性肾衰性贫血疗效最显著的生物技术药物，如肾性贫血、艾滋病患者贫血、癌症相关贫血等。,成熟的红细胞生成素是由165个氨基酸残基组成的糖蛋白，糖基化位点为Asn24、Asn28、Asn83和Ser126,有2对半胱氨酸组成的二硫键(Cys7-Cys61和Cys29-Cys33)，分子量为3436 ku(SDS-PAGE)、30.4 ku(超滤)或60 ku（凝胶电泳）。红细胞生成素前体带有27个氨基酸的信号肽。红细胞生成素基因存在于7q
17、11-q22区的一个5.4 kb Hind-BamH性内切酶切片段中。糖基化红细胞生成素对热和pH变化稳定，等电点为4.24.6，未经糖基化肽链等电点pH为9.2。,3、理化性质,2023/8/11,22,重组人红细胞生成素生产工艺,4、表达系统,Jacob等从噬菌体cDNA文库中筛选得到了编码红细胞生成素的cDNA片段，以此构建了SV40病毒启动子驱动表达的载体，在猴肾纤维母细胞COS-1中进行瞬时表达，测得了红细胞生成素的生物活性。Quelle等利用昆虫SF9细胞中的杆状病毒系统表达rhEPO。重组红细胞生成素在大肠杆菌中也得到表达，但所得rhEPO仅具有体外抗原结合活性。在哺乳动物细胞C
18、HO、BHK细胞系统中表达，获得的重组红细胞生成素与天然红细胞生成素相似。故现在工业生产中多采用动物细胞培养表达红细胞生成素进行大规模生产。,2023/8/11,23,重组人红细胞生成素生产工艺,5、表达载体,有两种方式获得编码人红细胞生成素基因。一种是提取胎肝染色体DNA，然后以特异性寡核苷酸为引物，经聚合酶链式反应扩增出人红细胞生成素的基因片段，然后与克隆载体连接，克隆基因。另一种是提取人胎肝mRNA，逆转录合成cDNA文库，进行文库筛选，得到人红细胞生成素基因。将人红细胞生成素基因与表达质粒重组，导入哺乳动物细胞，经筛选得到表达人红细胞生成素的细胞株。常用的表达载体有这两种质粒带有二氢叶
19、酸还原酶（dhfr）基因，也可以用不含dhfr基因的表达载体。常用的宿主细胞为CHO细胞。构建载体经过筛选后，必须通过测序，确证红细胞生成素的DNA序列及其推导的氨基酸序列是正确的。,2023/8/11,24,重组人红细胞生成素生产工艺,6、构建表达红细胞生成素的细胞株,以二氢叶酸还原酶缺陷型的中国仓鼠卵巢细胞系（CHO dhfr-）为宿主细胞。,7、CHO细胞培养工艺过程,种子细胞制备（1）冻存的细胞株37水浴复苏，无菌离心，弃去冻存液。（2）加入适量DMEM培养基（含10%小牛血清）。（3）37二氧化碳培养箱培养，连续传三代。（4）细胞消化后接种，接种的细胞浓度约为2.5106个/ml。,
20、2023/8/11,25,重组人红细胞生成素生产工艺,7、CHO细胞培养工艺过程,反应器连续培养（1）加入纤维素载体片及pH7.0的PBS缓冲液，5L细胞反应器高压灭菌1.5小时。（2）将反应器接入主机，连接气体，校正电极，排出PBS缓冲液。加含有小牛血清的DMEM培养基，接种。控制条件pH7.0，搅拌转速50 r/min，37，DO 50%80%，进行贴壁培养。（3）转速提高到80100 r/min，继续扩增培养10天。（4）更换为无血清合成培养基，由软件控制温度、溶氧、pH值等培养条件，进行连续灌流培养。（5）收获培养物，48保存。,2023/8/11,26,重组人红细胞生成素生产工艺,8
21、、培养工艺控制,搅拌速度：先慢后快温度：恒定的温度(37)pH值：细胞生长与表达的pH值为7.07.2。（通过输入CO2和碳酸氢盐溶液维持其恒定。）氧浓度：溶解氧应在10100的范围内。葡萄糖控制：是细胞生长与表达过程中必不可少的碳源之一，其消耗程度直接反映出细胞代谢旺盛程度。此外还应监测氨、乳酸盐类等代谢废物在培养基中的含量，维持在较低的浓度，减少对细胞损害。,2023/8/11,27,重组人红细胞生成素生产工艺,9、分离纯化工艺过程,初级分离：CMSephrose亲和层析柱预先用Na-HAc-异丙醇活化，并用20 mmol/L TrisHCl平衡缓冲液平衡。收获培养基滤膜过滤后上CM亲和层
22、析柱，平衡缓冲液平衡。02 mol/L NaCl，20 mmol/L Tris洗脱液梯度洗脱。收集活性洗脱峰10 mmol/L Tris透析液透析过夜。,精制：透析后的活性组分上预先平衡的DEAE离子交换柱。01 mol/L NaCl-Tris洗脱液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。上10%乙腈平衡的RP-HPLC柱（C4填料），10%70%的乙腈溶液梯度洗脱，收集活性洗脱峰。上凝胶柱（预先用20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡），20 mmol/L柠檬酸盐缓冲液平衡并洗脱，收集活性洗脱峰（红细胞生成素）。,2023/8/11,28,人体的内分泌系统由位于全身不同部位的内分泌腺构成。内分泌腺是一种无管
23、腺，其所分泌的活性物质称为激素，激素由腺细胞释放入毛细血管和毛细淋巴管，随血液循环运送到全身各器官和组织，从而发挥其生理作用。各种内分泌腺有的只分泌一种激素，有的则可分泌多种激素。各种激素对人体新陈代谢内环境的恒定，器官之间的协调以及生长发育等起调节作用。,返回,2023/8/11,29,丘脑下部：抗利尿激素、催产素脑垂体：远侧部：生长激素、催乳素、促肾上腺皮质激素、促黑素细 胞激素、促黄体生成素、促卵泡激素、促甲状腺素；中间部：促黑素细胞激素 神经部：抗利尿激素、催产素松果体：退黑激素、5-羟色胺、去甲肾上腺素甲状腺：甲状腺素甲状旁腺：甲状旁腺素胸 腺：胸腺素胰 腺：胰岛素、胰高血糖素肾上腺：皮质：盐皮质激素、糖皮质激素、雄性激素 髓质：肾上腺素、去甲肾上腺素性 腺：睾丸：雄性激素；卵巢：雌性激素、孕激素,返回,2023/8/11,30,返回,
