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1、细胞骨架组分的荧光染色观察,实验目的,掌握细胞骨架的显示方法掌握荧光显微镜的使用方法了解荧光显微镜下细胞骨架的基本形态结构,背景知识,常用荧光探针介绍,狭义的细胞骨架指细胞质骨架，包括微丝、微管和中间纤维。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质。,细胞骨架,2023/8/11,微管,2023/8/11,微丝,2023/8/11,中间纤维,背景知识,S.D.Pone用考马斯亮蓝染人皮肤成纤维细胞的细胞骨架获得成功。1982年上海植物生理所陈梓卿采用植物细胞为材料也获成功。实践证明这是一种简单易行的方法。当细胞用适当浓度的triton X-100溶液（聚乙二醇辛基苯基醚，
2、一种非离子去垢剂）处理，能够溶解质膜结构中及细胞内许多蛋白质，而微丝束结合得比较紧密，不容易被去除，经固定和染色后，可在光镜下观察到由微丝组成的纤维束。,细胞骨架研究中常用药物,实验原理,鬼笔环肽(phalloidin)是从一种毒性菇类中分离的剧毒生物碱，它同细胞松弛素的作用相反,只与聚合的微丝结合,而不与肌动蛋白单体分子结合。它同聚合的微丝结合后,抑制了微丝的解体,因而破坏了微丝的聚合和解聚的动态平衡。由于鬼笔环肽非常特异地结合并稳定聚合态肌动蛋白,因而对肌动蛋白的动态平衡造成严重影响.此外,较高浓度的鬼笔环肽对细胞有毒害作用.因此,用鬼笔环肽标记微丝并不是用于研究活体细胞的理想方法.,G-
3、actin,F-actin,ATP、Mg2+、高K+、Na+,Ca2+、低Na+、K+,实验步骤,材料：CHO（中国仓鼠卵巢细胞）、鸡胚成纤维细胞试剂：1.PEM：50mM pipes(pH6.9),5mM EGTA,5mM MgSO4,0.225M 山梨醇 2.0.5%Triton X-100溶于PEM缓冲液中。3.4%多聚甲醛溶于PEM缓冲液中。,取出盖片，于小平皿中37预温 PEM洗3次(每次 1mL),Triton X-100处理约10min(1mL),37预温 PEM洗3次(每次 1mL),37预温 4%多聚甲醛固定细胞15min(1mL),37预温 PEM洗3次,55nM Alex-phalloidin 10L湿盒中室温染色30min。,37预温 PEM洗数3次,滴加10L Ho.33342复染色,用小砂轮切去长方形盖玻片的一角作为标记以便识别细胞面。细胞密度60-80%,注意盖玻片的正反面,切勿产生气泡！,在parafilm 膜上加PEM，待盖玻片被冲起后，再轻轻揭下盖玻片。,避光操作,荧光镜下观察,注意事项,注意不要弄碎盖片，分清细胞所在面；各步洗细胞要轻，勿使细胞脱落；荧光观察注意避光操作节约试剂。,思考题,PEM缓冲液的作用是什么？0.5%Triton X-100处理细胞的作用是什么？鬼笔环肽用于细胞骨架研究的优缺点是什么？,
