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1、实验七培养基的配制与高压蒸汽灭菌,主 讲:徐尔尼生命科学学院生物技术系,一、目的与要求 了解培养基的配制原理。掌握配制培养基的一般方法和步骤。了解高压蒸汽灭菌的基本原理及应用范围。学习高压蒸汽灭菌的操作方法。,二、基本原理1、培养基的配制 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。用以培养、分离、鉴定、保存各微生物或积累代谢产物。培养基包括有：碳源物质、氮源物质、无机盐类、水等，由于培养的微生物种类不同，培养的目的不同，因此，培养基的组成也就不同。,二、基本原理2、高压蒸汽灭菌 高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸
2、汽。待水蒸汽急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于1000C的温度，导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,三、实验器材1、试剂或溶液用于配制培养基所需的各种化学试剂，1mol/L NaOH、1mol/L HCl等。2、仪器其他用具试管、500ml三角瓶、烧杯、培养皿、杜氏小倒管、量筒、玻棒、天平、称量纸、牛角匙、电炉、pH试纸（pH5.5-9.0）、试管塞、三角瓶塞、牛皮纸、记号笔、橡胶筋等。,四、操作步骤1、培养基的配制1）牛肉膏蛋白胨培养基称量加热溶化调pH至7.0-7.2分装在500ml三角
3、瓶内加塞包扎1210C灭菌20min2）淀粉培养基的配制称量 加热溶化 分装在250ml三角瓶内加塞 包扎 1210C灭菌20min,3）明胶培养基的配制称量加热溶化 调pH至7.2-7.4 分装在试管内，装量为试管高度的1/3为宜 加塞 包扎1210C灭菌30min 取出直立4）乳糖蛋白胨培养基的配制称量 加热溶化调pH至7.2-7.4 加入1.6%溴甲酚紫乙醇液指示剂 混匀分装在放有小倒管的试管中1150C灭菌20min5）葡萄糖蛋白胨培养基的配制称量（将乳糖改为葡萄糖）加热溶化 调pH至7.2-7.4 加入1.6%溴甲酚紫乙醇液指示剂 混匀 分装在放有小倒管的试管中 1150C灭菌20m
4、in,注意事项：称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品，或称取一种药品后，洗净，擦干，再取另一种药品。试剂瓶盖不要盖错。在配制好培养基后一定要注意调培养基溶液的pH。在烧杯融化琼脂和明胶的过程中，人要在电炉旁看着，以免培养基因沸腾而溢出烧杯。同时，需不断搅拌，以防琼脂和明胶糊底烧焦。分装过程中，注意不要使培养基沾在管口上，以免沾污试管塞而引起污染。,培养基配制实验分组与任务 一排为一组，6人/每组第1-2组：各配制200ml淀粉培养基，装入250ml三角瓶内。各装一筒培养皿，以备灭菌后用。第3-4组：各配制250ml明胶培养基，分装25支试管，每支试管装液量为试管高度的三分之一，灭菌后直立
5、摆放。第5组：配制300ml葡萄糖发酵培养基，分装成40支试管，每支试管装液量以浸没小倒管为宜。第6组：配制300ml乳糖发酵培养基，分装成40支试管，每支试管装液量以浸没小倒管为宜。第7组：配制400ml牛肉膏蛋白胨培养基,装入一个500ml三角瓶内。第8组：配制200ml牛肉膏蛋白胨培养基,分装成20支试管，每支试管装液量为试管高度的四分之一，灭菌后摆成斜面,四、操作步骤2、高压蒸汽灭菌检查高压锅水位 将待灭菌物品放在提篮里 盖上锅盖，旋紧螺丝 加热，打开放汽阀，排出冷空气 直至冒出白色蒸汽为止 关闭放汽阀 上磅至所需压力 维持至所需时间 切断电源 待压力降至零打开锅盖，取出灭菌物品 摆成
6、斜面或直立 冷凝后置370C培养箱内培养24h，检查灭菌是否彻底,灭菌锅留有不同分量空气时,压力与温度的关系,注意事项：要检查高压锅的水位，以免高压灭菌锅被损坏；要排尽高压锅内的冷空气，以免造成假压，达不到压力表所指示的相应温度。待压力表降为“0”时，放可打开高压锅锅盖，以免烫伤；,五、实验数据及处理结果 记录你配制的培养基的组成和各成分的实际用量，以及采用的灭菌温度及维持时间。,六、思考与讨论1、培养基配好后，为什么必须立即灭菌？如何检查灭菌后的培养基是无菌的。2、高压蒸汽灭菌锅开始灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么要待压力降为“0”时才能打开排气阀，开盖取物。3、灭菌在
7、微生物实验操作中有何重要意义？下次实验项目：大分子物质的水解和糖发酵试验,1）牛肉膏蛋白胨培养基牛肉膏 3g；蛋白胨 10g；NaCl 5g；琼脂15-20g；水1000mlpH 7.0-7.2；1210C灭菌20min。2）淀粉培养基的配制蛋白胨 10g；NaCl 5g；牛肉膏 5g；可溶性淀粉 2g；琼脂15-20g；水1000ml；1210C灭菌20min。3）明胶培养基的配制牛肉膏蛋白胨液 100ml 明胶12-18g；pH 7.2-7.4；1210C灭菌30min。4）乳糖（或葡萄糖）蛋白胨培养基的配制蛋白胨 10g；牛肉膏 3g；乳糖（或葡萄糖）5g；NaCl 5g；1.6%溴甲酚紫乙醇溶液 1ml；水1000ml；pH 7.2-7.4；1150C灭菌20min。,
