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1、实 验 五,培养基配制 及干、湿热灭菌,一.实验目的及要求,1.了解配制培养基的基本原理，掌握配 制方法 2.了解并掌握干、湿热灭菌的原理及方法,二.实验原理,(一)培养基 培养基是人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养物质，用以培养、分离、鉴定、保存各种微生物或积累代谢产物。不同微生物选用不同培养基，但是，不同种类的培养基中，一般应含有水分、碳源、氮源、无机盐、生长因素等。,按照配制培养基的营养物质来源可分为：天然培养基：利用天然的有机物配制而成的培养基。如：牛肉膏蛋白胨培养基。半合成培养基：既有天然物质又含化学试剂的培养基称半合成培养基。如马铃薯蔗糖培养基。合成培养基：采用多种化
2、学试剂配制的，各种成分及其用量都确切知道的培养基。如高氏一号培养基。根据培养基制成后的物理状态可分为：液体培养基：呈液体状态的培养基。固体培养基：外观呈固体状态的培养基。半固体培养基：将各种营养成份按比例配制成营养液后，加入适量固化剂，处于半固体状态的培养基。,培养基的分类,（二）干、湿热灭菌,干热灭菌是利用高温使微生物细胞内的蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。细胞内的蛋白质凝固性与其本身的含水量有关，在菌体受热时，当环境和细胞内含水量越大，则蛋白质凝固就越快，反之含水量越小，凝固缓慢。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。从而使沸点
3、增高，得到高于100的温度。导致菌体蛋白质凝固变性而达到灭菌的目的。,三.材料仪器,1.药品：牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、可溶性淀粉、K2HPO4、KH2PO4、蒸馏水、琼脂、1mol氢氧化钠、花生油、葡萄糖、溴甲酚紫、中性红、乙醇 2.器材：天平、药匙、瓷缸、玻璃棒、电炉、PH试纸、试管、三角瓶、移液管、牛皮纸、棉花、线绳、高压锅。,四.实验内容及方法,1.称量按照培养基配方，准确称量各成份放于烧杯（液体培养基）或三角瓶（固体培养基）中。2.溶解 向上述烧杯中加入所需要的水量，搅拌，加热使其溶解。如是配制固体培养基，在琼脂的熔化过程中，需不断搅拌，并控制火力不要使培养基溢出或烧焦。待完全熔化后，
4、补足所失水分。,培养基的制备过程称量-溶解-调节pH值-过滤-分装及包扎-灭菌-灭菌后试管摆放斜面,3.调节pH值 用玻璃棒沾少许液体，测量PH值。用氢氧化钠调节PH。4.过滤用滤纸或多层纱布过滤，一般无特殊要求可省去。5.分装及包扎 根据不同的需要，可将制好的培养基分装入试管内（用分装漏斗）或三角瓶内，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮纸将棉塞部分包好。6.灭菌：高压蒸汽灭菌，121 灭菌20分钟。7.灭菌后试管摆放斜面。,需配制的培养基,1、牛肉膏蛋白胨培养基（100ml）2、马铃薯培养基（200ml）3、油脂培养基（100ml）4、淀粉培养基（100ml）5、伊红美兰培养基（100ml）6、
5、蛋白胨水培养基（100ml）7、糖发酵培养基（100ml）8、葡萄糖蛋白胨水培养基（240ml）9、三倍浓缩的乳糖发酵培养基（150ml）10、普通浓度乳糖发酵培养基（300ml）,第一组：1、3、5、8、9 第二组：1、2、5、6、10 第三组：1、4、6、8,注意事项,固体培养基直接在三角瓶中配；液体培养基在烧杯中配制，后分装于试管中，每管10ml称取牛肉膏时，用玻璃棒挑取适量放在小称量纸上，直接放入三角瓶中，待牛肉膏完全溶化后，取出称量纸（注意：不要将玻璃棒插入瓶底）马铃薯去皮，切成小块（1cm1mm）放在白瓷缸（加水300ml）中煮，待水煮沸后继续煮30分钟，并不停搅拌和补水，然后过滤
6、，在加入其它成分,称取适量可溶性淀粉，加入适量水中，加热使其充分溶化后在加入其它成分。糖发酵培养基（蓝紫色）、三倍浓缩的乳糖发酵培养基（蓝紫色）及普通浓度的乳糖发酵培养基（蓝紫色）配好后，分装于试管中，加入德汉氏小管（倒置）配制固体培养基时，琼脂在调好pH值后加调pH值时注意慢慢加NaOH，不要一下子调过头称量要准确，最后一位同学称完药品后，将药勺取出来，盖好瓶盖,收好砝码含葡萄糖及乳糖的培养基在115摄氏度灭菌，其余在121摄氏度灭菌,每组同学需完成的工作,第一小组配制五种培养基第二小组配制五种培养基第三小组配制四种培养基，准备1个装45ml水带玻璃珠的三角瓶、准备10支1ml移液管、准备9
7、支装9 ml水的试管、准备土样三组同学准备其它样品,加水至外筒内，被灭菌物品放入内筒。盖上灭菌器盖，拧紧螺旋使之密闭。通电加热，同时打开排气阀门，排净其中冷空气。待冷空气全部排出后（即水蒸气从排气阀中连续排出时），关闭排气阀。继续加热，待压力表渐渐升至所需压力时(一般是101.53kPa，即15磅/英寸2，温度为121.3)，开始计时，维持15-30min。灭菌时间到达后，停止加热，待压力降至零时，慢慢打开排气阀，排除余气，开盖取物。切不可在压力尚未降低为零时突然打开排气阀门，以免灭菌器中液体喷出。,高压蒸汽灭菌器使用方法,手提式高压蒸汽灭菌器示意图,作业：,1.在配制培养基的操作过程中应注意些什么问题？为什么？2.你配制的高氏一号培养基有沉淀产生吗？说明产生或未产生的原因。3.高压蒸气灭菌开始之前，为什么要将锅内冷空气排尽？灭菌完毕后，为什么待压力降低为“0”时才能打开排气阀，开盖取物？,
