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1、小鼠骨髓细胞染色体标本的制备与观察,实验目的：1初步掌握动物骨髓细胞染色体的制备方法。2了解小鼠骨髓细胞染色体的形态特点。,实验原理：染色体是细胞分裂时期遗传物质存在的特定形式，是染色质紧密包装的结果。染色体是有机体遗传信息的载体，对染色体的研究在生物进化、发育、遗传和变异中有十分重要的作用。,核型分析均是以中期染色体为标准，对制作出的染色体标本进行照相以获得染色体的显微图像，并将其剪裁排列即成，或用专用软件进行分析排列。凡处于活跃增殖状态的细胞，或者经过各种处理后，细胞就可进入分裂期此时均可用于染色体分析。,在正常动物体内，骨髓是处于不断分裂的组织之一。此时给动物注射一定剂量的秋水仙素可使许
2、多处于分裂的细胞停滞于中期（秋水仙素可阻断纺锤丝微管的组装），然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可供分析的染色体标本。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作。,实验材料：实验器材：离心管、低速离心机、吸管、牙签、剪刀、载玻片、显微镜等。实验试剂：100g/ml秋水仙素、0.075M KCl、Carnoy固定液、Giemsa 染液、pH6.8磷酸缓冲液、0.85%NaCl生理盐水、0.4%KCl（低渗液）等。小鼠腿一只,实验步骤：1秋水仙素注射 称出小白鼠的体重，然后按24g/g体重的剂量经腹腔注射秋水仙素，34h后颈椎脱臼法处死。2取出股骨 取出小鼠后肢的股骨，剔除附着的肌肉
3、，剪去股骨两端关节。3剪碎股骨于生理盐水 直接用手术剪将股骨剪碎于含有5 ml 0.85%NaCl的培养皿中，反复剪碎，使骨髓细胞析出，溶液成悬液状。4收集细胞 用吸管反复吸打细胞，使细胞团块分散，转入两支1.5ml离心管中。注意股骨碎片不要吸入离心管中。3000 rpm离心10分钟收集细胞。弃去上清。（注意：可合并两支管内沉淀）,5室温低渗 加入0.4KCl溶液1ml，轻微吸放混匀细胞，然后将离心管在室温下低渗20min。6Carnoy固定液预固定 低渗结束后在离心管中加入0.5ml Carnoy固定液进行预固定，用吸管轻微混匀，可避免细胞结块，室温固定5分钟后，混匀以2000 rpm离心1
4、0min。7 Carnoy固定液重新固定 弃去上清液，沿离心管壁缓慢加入新配制的甲醇：冰醋酸(3:1)固定液1.5ml，用滴管小心将细胞团块打散，继续固定10分钟。82000 rpm离心10分钟，留少量固定液后用滴管小心将细胞团块打散，制成均匀的细胞悬液。,9在干净、湿冷的载玻片上以高距离滴23滴上层细胞悬液，气干或在酒精灯上文火烘干。注意在滴片时要有一定的高度（大于40cm），使细胞膜破裂后易于使染色体散开，并尽量使滴片上的细胞分布均匀，不要重叠。,10气干，染色。在一块洁净的玻板上，将玻片标本有细胞的一面朝下用牙签架空于玻板上。11用滴管将配好的染液充满于玻板与载玻片之间的空隙中，注意载片
5、上有细胞面的进行染色并在滴加染液时注意排除气泡。视室温而定，染色15分钟。12染色后，轻轻揭起玻片，倾斜玻片在自来水管下细水流冲洗数秒，冲掉染液，擦干玻片标本底面和四周，显微镜观察和分析。注意不要搞错沾有细胞的一面。选择染色较好、较分散、形态清晰的细胞分裂相，进行显微观察。,结果与讨论：绘制染色体图：（小鼠骨髓细胞染色体）,对于小鼠骨髓细胞染色体标本的制作，一般包括以下几个要点：（重点）1用一定剂量的秋水仙素破坏纺锤丝的形成，使细胞分裂停滞在分裂中期，使中期染色体停留在赤道面处。2用低渗法使将细胞膨胀，以至于在滴片时细胞被胀破，使细胞的染色体铺展到载玻片上。3空气干燥法可使细胞的染色体在载片上展平，经Giemsa染色后便可观察到染色体的图像。4倒置染色法：在玻璃板上用牙签做支架，使标本载玻片的标本面向下放置到支架上，然后用滴管在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，在操作时应注意，滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不被着色。此法一是可以节省染料，二可以避免染液快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀，影响观察。,
