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1、2008-04-23,1,细胞死亡概述,张红梅,2008-04-23,2,细胞死亡是生物界普遍存在的现象，不同于机体死亡。正常组织中，每天都有千千万万个细胞死亡。细胞死亡的方式通常有2种：细胞坏死（necrosis）细胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）,2008-04-23,3,细胞坏死（necrosis）,概念：细胞坏死是细胞受到强烈理化或生物因素作用引起细胞无序变化的死亡过程。表现为细胞胀大，胞膜破裂，细胞内容物外溢，核变化较慢，DNA降解不充分，引起局部严重的炎症反应。主要形态学特征：细胞发生肿胀，最后导致细胞膜破裂和溶解，细胞内前炎症因子等内容物释放，引
2、起严重的炎症反应。细胞坏死现象与人类多种疾病相关。如病毒感染引起的急性重型肝细胞坏死，青光眼导致神经细胞坏死，造成视力逐渐减弱，最终导致失明。,2008-04-23,4,程序性细胞死亡(programmed cell death，PCD),与细胞坏死不同，程序性细胞死亡是受基因控制的另一种细胞死亡方式，是生物体在漫长进化过程中逐步建立起来的“自杀机制”。即细胞在一定的生理或病理条件下，遵循特定的程序，结束自身生命的过程。诱发因素：包括体外因素，如射线、药物和病毒感染等；体内因素，如肿瘤、自身免疫病和退行性病变等。典型形态学特征：细胞膜完整、无前炎症因子等细胞内容物流出，无炎症反应。程序性细胞死
3、亡是机体稳定内环境和平衡细胞数量的重要调节机理。,2008-04-23,5,程序性细胞死亡的分类类型,（一）基于机制的程序性细胞死亡分类：1.细胞凋亡（apoptosis）2.自噬性细胞死亡（autophagic cell death）3.类凋亡（paraptosis）4.有丝分裂灾难（mitotic catastrophe）5.胀亡（oncosis）（二）基于形态的程序性细胞死亡分类1.基于细胞核改变的分类2.clarke分类（三）形态学分类与机制分类的关系,2008-04-23,6,细胞凋亡（apoptosis）,细胞凋亡一词最早是由英国的病理学家科尔和希腊语教授马克于1972年提出的。在
4、希腊语中，apo的意思是脱离，ptosis的意思为落下，将这两个词组合（apoptosis）用来描述与秋叶落下和花儿凋谢类似的细胞死亡现象。到1990年代，细胞凋亡的研究获得了里程碑式的重大进展，证明细胞凋亡是基因调控的主动过程，典型的细胞凋亡过程涉及一系列胱天蛋白酶（caspase）的水解、活化和信号传递过程。,2008-04-23,7,细胞凋亡的生理意义,细胞凋亡的生理意义：细胞凋亡对于保证个体正常发育、维持正常生理功能，并使机体适应内外环境的变化具有重要的生理意义。,2008-04-23,8,细胞凋亡的生理意义,细胞凋亡与胚胎发育、组织发生、组织分化和修复等过程有紧密的联系。为适应发育或
5、组织更新的需要，机体中的细胞会在某些特定的时刻发生凋亡。例如：在皮肤外层细胞的形成过程中，皮肤细胞生成于皮肤深层，然后慢慢向外表面迁移，迁移途中有些会发生凋亡，凋亡细胞就会形成具有保护作用的皮肤角质层。又如，人的唯一透明组织眼球晶状体的发育，在胎儿形成早期阶段，由干细胞发育来的晶状体细胞与其他所有细胞一样都含有细胞器，但随着发育和分化的进展，晶状体细胞发生特殊形式的凋亡，胞质中的细胞核和细胞器被毁坏，只保留完整的细胞膜，细胞膜内包裹着极浓稠的“晶状体蛋白质”溶液，成为成熟的晶状体。,2008-04-23,9,细胞凋亡的生理意义,此外，在成年阶段，细胞凋亡也是机体清除体内多余的、受损的、癌变的或
6、被微生物感染的细胞的重要手段。如T淋巴细胞在胸腺成熟过程中，约有95%以上不成熟的细胞发生凋亡，只有不到5%的细胞分化为成熟的T淋巴细胞进入外周血，并发挥其免疫学功能。,2008-04-23,10,细胞凋亡的病理意义,细胞凋亡的病理意义：细胞凋亡调节失控或错误将会引起生物体的发育异常、功能紊乱和严重疾病。与细胞凋亡相关的疾病如滤泡性淋巴瘤、乳腺癌和白血病等恶性肿瘤，系统性红斑狼疮和肾炎等自身免疫性疾病，腺病毒和疱疹病毒感染的疾病等，均与细胞凋亡缺陷（“该死不死”）有关；而阿尔茨海默病、帕金森氏病和小脑退化症等神经退行性疾病、骨髓发育不全性疾病、缺血性损伤和酒精中毒性肝炎等则与细胞凋亡过度（“不
7、该死的死了”）有关。,2008-04-23,11,尽管细胞凋亡是了解最多的一种程序性细胞死亡过程，但是近期研究认为自我吞噬作用是一种高度调节、异化过程，能使细胞自己吃掉自己。有趣的是，自我吞噬还能为细胞提供在不能进行凋亡时的一种替代形式的自我毁灭。,2008-04-23,12,自噬性细胞死亡（autophagic cell death）,概述：自噬性细胞死亡的现象早在20世纪60年代就已发现，它是指细胞内的溶酶体降解自身细胞器和其他大分子的过程。形态学特征：电镜下可观察到胞质中有大量包裹着细胞浆和细胞器的空泡结构，称作自噬泡，胞质浓缩，质膜通透性改变。主要过程：自噬泡与溶酶体发生融合，自噬泡所
8、包裹着的待降解物质进入溶酶体，在各种酶的作用下分解成氨基酸和核苷酸等，并进入三羧酸循环，产生小分子和能量（ATP），再被细胞所利用。,2008-04-23,13,自噬性细胞死亡（autophagic cell death）,长期以来细胞自噬被认为是细胞的自救行为，溶酶体参与其中的全过程。但近年发现，在某些条件下，细胞自噬也能导致细胞死亡，并证明自噬的发生受多种基因的严格调控，如ATG（autophagy）基因、蛋白激酶基因和磷酸酶基因等。迄今至少已鉴定了30种参与酵母自噬的特异性基因，统一命名为酵母自噬相关基因Atg(autophagy-related genes)。在哺乳动物中也分离鉴定到许
9、多自噬相关基因，大多与酵母自噬相关基因高度同源，表明细胞自噬在进化上是高度保守的。,2008-04-23,14,自噬性细胞死亡（autophagic cell death）,哺乳动物细胞中由Atg5-Atg12-Atg16L组成的复合物是形成自噬体双层膜结构所必需的，LC3-的含量或LC3-/LC3-的比例与自噬泡形成的数量呈正相关。Beclin-型磷脂酰肌醇三磷酸酶（Class PI3K）复合物和Sec基因（Sec12、Sec16、Sec23/24）参与自噬体的形成。与此相反，氨基酸、ATP和激素的感受器TOR激酶和G蛋白亚基Gai3是细胞自噬活动的负调控因子。,2008-04-23,15,
10、自噬性细胞死亡的意义,自噬也是细胞适应内外环境或满足自身发育需要的一种调节方式。细胞自噬与疾病的发生发展有密切的关系。在心肌和骨骼肌中，过度自噬会导致-葡糖苷酶缺失，引起糖原分解障碍，使糖原发生堆积，导致型糖元贮积病的发生。在神经细胞中变性蛋白的过度堆积是帕金森病、阿尔茨海默病和亨廷顿病等神经退行性疾病的主要病理特征。患病早期，被激活的细胞自噬行为能清除这些变性蛋白，但随着病情的发展，当变性蛋白的积累速率超过自噬的清除能力，就会引起自噬的过度激活，发生自噬性细胞死亡，加重病情发展。,2008-04-23,16,自噬性细胞死亡的意义,在机体受到脊髓灰质炎病毒和SARS冠状病毒等病原体感染时，细胞
11、自噬具有双重作用。一方面，细胞自噬能将进入胞内的病原体，通过降解作用加以清除，保护正常细胞不被感染；另一方面，细胞自噬形成的自噬泡双层膜结构成为病毒或细菌的“避难所”，使其逃避宿主的清除作用。因此，细胞自噬对人类健康是一把双刃剑。,2008-04-23,17,人们对细胞凋亡和自噬的认识主要从细胞形态、理化性质、调节基因和病理表现等方面加以辨认。随着对细胞自噬现象和机制的渐深了解，人们发现细胞自噬与凋亡之间似乎存在着某种调控机制，可调节二者的相互拮抗或促进或相互替换（substitute）。,2008-04-23,18,例如，自噬相关调控基因Beclin/Atg6能上调caspase-9的活性，
12、增强化疗药物CDDP诱导人胃癌细胞MKN28的凋亡；应用RNA干扰技术封闭Atg基因（Atg5、Atg6/Beclin、Atg10、Atg12）或者使用autophagy特异抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-methyladenine，3-MA）处理，细胞在营养被剥夺的情况下，发生凋亡型的程序性细胞死亡；Caspase广谱抑制剂Z-VAD能通过抑制caspase-8的活性，诱导Atg7和Beclin基因参与的自噬性细胞死亡。,2008-04-23,19,类凋亡（paraptosis）,词根para-为“接近，相似”之意。2000年Sperandio等在293T细胞系中超表达胰岛素样生长因子1受体（IG
13、FIR）时发现一种与经典凋亡不同的死亡表型，并定义为Paraptosis。形态学特征：细胞浆空泡化，线粒体和内质网肿胀，但没有核固缩现象。目前，paraptosis的研究主要集中在形态学上，与细胞坏死和细胞凋亡的形态表现不同，区别见下表。,2008-04-23,20,Paraptosis与细胞坏死、细胞凋亡的形态差异,2008-04-23,21,现在Paraptosis的文献报道比较少，其机制有待于进一步深入研究。高剂量的IGF或胰岛素等营养因子可以通过IGFIR活化MAPK/ERK以及JNK通路引起Paraptosis的发生，并且可以被AIP1/Alix特异性地抑制。,2008-04-23,
14、22,Paraptosis细胞的检测,下面介绍四种常用的检测方法：1)琼脂糖凝胶电泳观察染色质DNA被核糖内切酶降解产生的“阶梯状DNA区带”：paraptosis细胞为阴性。2)ISEL(DNA原位缺口转移)，TUNEL(DNA原位末端标记法)：paraptosis细胞为阴性。3)凋亡抑制剂检测：caspase蛋白酶抑制剂(如：z-VADfmk，BAF，p35)和Bcl家族(如：Bcl-XL)都不能抑制paraptosis细胞死亡。4)细胞凋亡的酶学分析：caspase-3、PARP片段分析为阴性。通过以上方法可进一步证明paraptosis是与凋亡不同的另外一种程序性细胞死亡方式。,200
15、8-04-23,23,Paraptosis过程中的生化机制,1）Paraptosis需要转录和翻译 放线菌素D和放线菌酮能阻断paraptosis产生，证明paraptosis过程中有活跃的RNA及蛋白质合成。而在细胞凋亡中，有无转录和翻译则取决于细胞类型和细胞凋亡的刺激物。在坏死的细胞中则完全没有RNA和蛋白质的合成。,2008-04-23,24,2）调控paraptosis的信号途径 CD47可作为淋巴细胞上的死亡受体，激活non-classical form of apoptosis，不依赖于caspase介导细胞死亡。3）Paraptosis的产生需要Caspase-9 此反应是cas
16、pase-9特异性的，但这种细胞死亡方式不具备线粒体依赖的细胞凋亡路径，即没有细胞色素C的释放和凋亡小体的形。,2008-04-23,25,4）Paraptosis与细胞色素C Margaret用糖皮质激素在过氧化氢酶或硫氧还蛋白过度表达的胸腺细胞中诱导出paraptosis，该细胞的线粒体不向胞浆中释放或延迟释放Cyt C。5）与paraptosis相关的基因 可能与bcl-2基因和p53基因无关。,2008-04-23,26,Paraptosis的病理生理意义,1.与神经变性和何杰金氏淋巴瘤有关。2.与细胞分化、生物体发育有关。,2008-04-23,27,细胞有丝分裂灾难（mitioti
17、c catastrophe）,1989年，Lisa Molz等发现在酵母的一种对热敏感的突变株中，细胞分裂时染色体分离发生异常。相应的一些学者便把这种在DNA发生损害时，细胞无法进行完全的分裂从而导致四倍体或多倍体的现象称为细胞有丝分裂灾难。,2008-04-23,28,形态学特征：主要是巨细胞的形成，内有多个小核，染色质凝聚。DNA发生损害时，如果细胞不能有效地阻断其细胞周期的进行，会导致染色体的异常分离，这些非正常分裂的细胞在下一轮有丝分裂中会继续导致细胞多倍体的形成从而成为癌变的基础。而细胞有丝分裂灾难作为一种死亡机制可以使这种非正常分裂的细胞死亡。细胞有丝分裂灾难由多种分子调控，如CD
18、K1，P53及Survivin等，其死亡信号传递有很大一部分与凋亡相重叠。,2008-04-23,29,胀亡（oncosis）,1910年，von Reckling-hausen在骨软化病中发现由于缺血而肿胀坏死的骨细胞，他把这种肿胀坏死叫做Oncosis。1995年Majno和Joris为与凋亡相区别，重新引入了Oncosis的概念，把具有明显肿胀特点的细胞死亡命名为Oncosis，中文一般翻译为胀亡。胀亡的形态学特征是细胞肿胀，体积增大，胞浆空泡化，肿胀波及细胞核、内质网、线粒体等胞内结构，胞膜起泡，细胞膜完整性破坏。胀亡细胞周围有明显炎症反应。,2008-04-23,30,对于胀亡发生的
19、机制现有的文献阐述较少，有研究者认为胀亡只是坏死前的一个被动性死亡阶段。但是近年来的研究更倾向于胀亡是一个程序性的死亡方式，如抗Porimin的单抗可以引起Jurkat细胞的胀亡；解偶联蛋白高表达的组织或细胞易发生胀亡，其原因是这些细胞缺乏ATP，故其膜上的离子泵功能丧失从而导致胀亡，而抑制解偶联蛋白可以抵抗胀亡却不能抵抗凋亡，提示胀亡可能有与凋亡不同的死亡机制。,2008-04-23,31,程序性细胞死亡的分类类型,（一）基于机制的程序性细胞死亡分类：1.细胞凋亡（apoptosis）2.自噬性细胞死亡（autophagic cell death）3.类凋亡（paraptosis）4.有丝分
20、裂灾难（mitotic catastrophe）5.胀亡（oncosis）（二）基于形态的程序性细胞死亡分类1.基于细胞核改变的分类2.clarke分类（三）形态学分类与机制分类的关系,2008-04-23,32,基于细胞核改变的分类,细胞核在细胞死亡时变化比较明显，所以很多人以此为标准将细胞死亡分为凋亡、凋亡样程序性细胞死亡、坏死样程序性细胞死亡和坏死，其中前三种是程序性细胞死亡，坏死是非程序性细胞死亡。,2008-04-23,33,凋亡细胞核的特点：染色质凝聚，成球状或半月状。还有磷脂酰丝氨酸外翻、细胞皱缩、凋亡小体形成等。凋亡一般都会伴有Caspase尤其是Caspase3的活化。凋亡样
21、程序性细胞死亡核的特征：染色质凝聚的程度较低，比凋亡细胞的染色体疏松一些，同时可以有凋亡细胞其它方面的形态学的变化，多数文献中描述的Caspase非依赖的凋亡归于此类。坏死样程序性细胞死亡一般无染色质的凝聚或者只有疏松的点状分布，一些特殊的Caspase非依赖的死亡归于此类。,2008-04-23,34,线粒体在细胞死亡中扮演着核心角色，其所释放的促进细胞死亡的分子大致有三类。第一类是细胞色素C，它与胞浆里的Apaf-1，ATP和Caspase-9前体分子形成Apoptosome，引起Caspase-9的激活，进而激活Caspase-3，引起典型的凋亡。第二类是超氧自由基，可以使细胞发生坏死样
22、程序性细胞死亡，且此效应可以被抗氧化剂所拮抗。第三类是AIF，AIF可以切割染色体产生大的DNA片段（约50kB），使细胞发生凋亡样程序性细胞死亡。,2008-04-23,35,Clarke分类,1990年Clarke等补充了Schweichel和Merker对于细胞死亡的分类，将程序性细胞死亡分为I类、II类和III类，至今仍被广泛应用。I类程序性细胞死亡即是凋亡，这类死亡一般没有溶酶体的参与，且死后会被吞噬细胞所吞噬。II类程序性细胞死亡即是自吞噬性程序性死亡，其主要的形态学特征是自吞噬泡的形成，自吞噬泡和溶酶体融合后被消化，细胞残骸被吞噬细胞吞噬。III类程序性细胞死亡即是坏死样程序性细
23、胞死亡，其主要的形态学特征是各种细胞器的肿胀、胞膜的破坏等，这类细胞死亡没有溶酶体的参与，细胞器的肿胀表现比较明显，而且死亡后会被吞噬细胞吞噬。,2008-04-23,36,程序性细胞死亡的分类类型,（一）基于机制的程序性细胞死亡分类：1.细胞凋亡（apoptosis）2.自噬性细胞死亡（autophagic cell death）3.类凋亡（paraptosis）4.有丝分裂灾难（mitotic catastrophe）5.胀亡（oncosis）（二）基于形态的程序性细胞死亡分类1.基于细胞核改变的分类2.clarke分类（三）形态学分类与机制分类的关系,2008-04-23,37,形态学分
24、类与机制分类的关系,2008-04-23,38,新发现的细胞死亡方式,1.坏死性细胞凋亡（necroptosis）2.entosis,2008-04-23,39,坏死样细胞凋亡（necroptosis）,坏死细胞凋亡是最近由美国袁筠英教授及其同事发现并证明的一种新现象。该现象发生在广谱caspase抑制剂Z-VAD存在的条件下，TNFR1与其相应的天然配体结合后发生的一种具有坏死样形态特征和自噬活化作用的程序性细胞死亡。为了进一步确定该现象的存在，他们通过对大约15000种化合物的筛选，找到一种称作necrostatin-1（Nec-1）的小分子化合物，能阻断坏死样细胞凋亡发生的关键步骤，而特
25、异性地抑制坏死样细胞凋亡。,2008-04-23,40,Entosis-2007年“细胞死亡”新发现,在2007年年底，哈佛医学院细胞生物学系，布莱根妇女医院（Brigham and Womens Hospital），贝斯以色列女执事医疗中心（Beth Israel Deaconess Medical Center，BIDMC）的研究人员发现了一种全新的，奇异的细胞侵入细胞的死亡过程，并命名为entosis，即“Within”，“inside”的希腊文。这一研究成果公布在Cell杂志上。,2008-04-23,41,背景介绍,几十年来，科学家曾偶尔观察到有些细胞卷入到其他细胞中的情况，但均没有
26、进一步研究。美国哈佛医学院的细胞生物学家Michael Overholtzer和小组在研究正常乳腺细胞的时候发现，当生长在基膜上的乳腺细胞分离后，有些细胞被包裹进了另外的细胞中。新发现的这种细胞死亡方式不同于细胞凋亡，不会在细胞膜和细胞核分裂过程中产生不规则隆起，而是有些细胞会进入到其它细胞中，导致死亡。,2008-04-23,42,用红、绿荧光染料标记示踪细胞，激光共聚焦显微镜观察显示小细胞陷入到大细胞中。,2008-04-23,43,细胞entosis的超微结构,超微结构研究显示被卷入的细胞没有显示出凋亡或者坏死的特征，维持线粒体膜电位的完整性。,2008-04-23,44,time-la
27、pse microscopy（时间推移显微镜）观察显示，细胞内陷大概在脱离基膜3-6h开始，需要经历几小时完成。,2008-04-23,45,Bcl-2的过表达和caspase抑制剂能够抑制细胞凋亡，但是对细胞的卷入或内陷（internalizing）没有影响。,细胞卷入不依赖于细胞凋亡过程。,2008-04-23,46,经过深入研究，研究小组发现，被卷入到别的细胞的乳腺分离细胞中，有70%死亡，9%进行了分裂，18%最后被完好无损地释放出来。另外，阻止凋亡和噬菌作用等其他细胞死亡方式并不会中断entosis，这证明了entosis具有独特的作用机制。,2008-04-23,47,由于与基质的
28、分离（脱落）导致的细胞内陷，又叫entosis，不依赖于细胞凋亡，与caspase激活或者磷脂酰丝氨酸外翻无关，与基质剥夺有关。entosis也不同于凋亡细胞的吞噬消化过程，但是依赖于细胞之间的粘着连接，是一个细胞侵入另一个细胞的过程，详细的机制不清楚。进一步的实验表明，保持细胞间相互连接的钙黏着蛋白对于entosis是必需的。研究人员推测，当细胞从基膜上分离时，它们之间支持力的不平衡导致了entosis的发生。,2008-04-23,48,有关entosis的意义争论,Entosis是广泛存在的。在多种细胞类型中，包括乳腺、卵巢、脐带、肾癌细胞等，均发现了它存在的证据。Overholtzer
29、认为，entosis可能的一个功能是抑制肿瘤。因为当在乳腺癌细胞系中用化学制剂抑制entosis后，细胞群落形成(试管中肿瘤生长的指示剂)增长了10倍。相反，美国福克斯蔡斯癌症中心的分子生物学家Maureen Murphy认为，entosis可能被癌细胞用作存活的工具，癌细胞利用它来逃脱化学药物和免疫系统的识别。这也可能解释了为什么不是所有经历entosis期的分子都会死亡。,2008-04-23,49,结语,随着对细胞死亡的深入研究，越来越多的新的细胞死亡方式正逐渐被发现和研究。细胞具有多种死亡方式是有其进化必然性的。多细胞生物在生命过程中会有大量“多余的”或“生病的”细胞死掉，单一的死亡方式对于生命来说是十分危险的，因为一旦此通路受到抑制，后果将不可想象。多种死亡方式的存在就像一个多重保险，会“千方百计”地使应该死亡的细胞死掉，即便是某些死亡通路受阻。,
