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1、干扰素制备的工艺流程,生命科学学院生物技术2010级7班,什么是干扰素？,概念(interferon,IFN)：机体免疫细胞产生的一类细胞因子，是机体受到病毒感染时，免疫细胞通过抗病毒应答反应而产生的一组结构类似、功能接近的生物调节蛋白。根据分子结构和抗原性的差异分为、等4个类型。,干扰素又依其结构分为1b、2a、2b等亚型 其区别在于个别氨基酸的差异上，早期干扰素是用病毒诱导人白血球产生的，产量低、价格昂贵，不能满足需要，现在可利用基因工程技术并在大肠杆菌中发酵、表达来进行生产。,目的基因的分离,克隆载体,目的基因与克隆载体的体外重组,重组体导入大肠杆菌K12,受体菌的培养及筛选,从受体菌中
2、获取目的基因,表达载体,重组质粒,导入大肠杆菌,受体菌的筛选，表达性、稳定性等检测,工程菌,基因工程菌的制备,一、目的基因的分离与获得,1.设计合成干扰素基因的两端引物（完全的），每条引物内或5-端最好有内切酶酶切位点。2.有药物诱导细胞，如佛波酯，使细胞表达干扰素升高。3.破碎细胞，提取细胞总mRNA.4.用逆转录试剂盒逆转录，把总mRNA逆转录成cDNA5.以cDNA为模板、干扰素引物为引物，PCR，得到完全的干扰素基因的PCR产物,二、目的基因与克隆载体进行体外重组,1.提取载体（质粒、病毒等），双酶切，再把干扰素基因的PCR产物用相应的酶酶切，用连接酶连接,EcoR I,BamH I,
3、EcoR I,BamH I,2.连接完成后分离纯化，测序，与原干扰素序列比对。3.鉴定序列无误后（无义突变也行），导入受体细胞，筛选,三、重组体引入宿主细胞,将cDNA克隆到含有四环素、氨苄青霉素抗性基因的质粒pBR322中，转化到大肠杆菌，重组的载体 DNA 分子在一定条件下转化入大肠杆菌，形成携带质粒的菌株。,四、从大肠杆菌k12获取目的基因,由于质粒重组时有3种基本方式，即：目的基因与克隆载体重组，目的基因片段与目的基因片段重组，克隆载体与克隆载体重组；另外重组过程可能会发生基因突变情况 流程：步骤一：将细菌涂布到含氨苄青霉素的培养基上培养，就可得到质粒PBR322或重组质粒的细菌单菌落
4、。步骤二：步骤一获得的每一个细菌单菌落标记为a、b、c、d等，在每一个单菌落中挑取部分细菌转涂到含有四环素的培养基上，不能生长的是绝大部分含有重组质粒的细菌及少量可能发生突变的非重组质粒的细菌单菌落。原因：因为PBR322含有抗四环素基因，重组质粒中目的基因插在抗四环素基因中，使其结构破坏，失去抗四环素作用。,五、提取重组质粒,1、对上一步获得含目的基因的大肠杆菌在含有氯霉素的培养基中扩大培养15h。培养时间：前人实验证实大肠杆菌K12生长前6h为迟缓期,615.5h为对数增时期,15.5 19.5h为稳定期,19.5h后为衰亡期。氯霉素：氯霉素可抑制宿主的蛋白质合成，结果阻止了细菌染色体的复
5、制，然而，松弛型质粒仍可继续复制。2、细菌的收获和裂解）用合适转头于4以4000转/分离心15分钟，弃上清，敞开离心管口并倒置离心管使上清全部流尽。,）将细菌沉淀重悬于100ml用冰预冷的STE中。STE0.1mol/L NaCl10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)1mmol/L EDTA(pH8.0)按步骤）所述方法离心，以收集细菌细胞。3、碱裂解法）将冼过的500ml 培养物的细菌沉淀物 来自收获细菌的步骤3 重悬于10ml（18ml）溶液中。溶液:50mmol/L葡萄糖25mmol/L Tris.Cl(pH8.0)10mmol/L EDTA(pH8.0)溶液可成批配制，在10
6、lbf/in2(6.895x104Pa)高压下蒸气灭菌15分钟，贮存于。,）加1ml(2ml)新配制的溶菌酶溶液10mg/ml,溶于10mmol/L Tris.Cl(pH8.0)。当溶液的pH值低于8.0时，溶菌酶不能有效工作。）加20ml(40ml)新配制的溶液。溶液:0.2mol/L NaOH(临用前用10mol/L贮存液现用现稀释）1SDS盖紧瓶盖，缓缓颠倒离心瓶数次，以充分混匀内容物。于室温放置5-10分钟。）加15nl(20ml)用冰预冷的溶液。溶液:5mol/L乙酸钾 60ml冰乙酸 11.5ml水 28.5ml,所配成的溶液对钾是mol/L，对乙酸根是5mol/L。封住瓶口，摇动
7、离心瓶数次以混匀内容物，此时应不再出现分明的两个液相。置冰上放10分钟，应形成一白色絮状沉淀。于0放置后所形成的沉淀应包括染体DNA、高分子量RNA和钾SDS蛋白质膜复合物）用合适转头于4以4000转/分离心15分钟，不开刹车而使转头自然停转。如果细菌碎片贴壁不紧，可以5000转/分再度离心20分钟，然后尽可能将上清全部转到另一瓶中，弃去残留在离心管内的粘稠状液体。未能形成致密沉淀块的原因通常是由于溶液与细菌裂解物混合不充分,）上清过滤至一250ml离心瓶中，加0.6体积的异丙醇，充分混匀，于室温放置10分钟。）用合适转头于室温以500转/分离心15分钟，回收核酸。如于4离心，盐也会了生沉淀。
8、）小心倒掉上清，敞开瓶口倒置离心瓶使残余上清液流尽，于室温用70乙醇洗涤沉积管壁。倒出乙醇，用与真空装置相联的巴期德吸出附于瓶壁的所有液滴，于室温将瓶倒置放在纸巾上，使最后残余的痕量乙醇挥殆尽。）用3ml TE(pH8.0)溶解核酸沉淀。10）纯化。,六、质粒DNA的纯化,（一）聚乙二醇沉淀法提取质粒）将核酸溶液所得转入15mlorex 管中，再加3ml 用冰预冷的5mol/L LiCl溶液，充分混匀，用合适转头于下以10 000转/分离心10分钟。LiCl可沉淀高分子RNA。）将上清转移到另一30mlCorex管内，加等量的异丙醇，充分混匀，用SorvallSS34转头（或与其相当的转尖）于
9、室温以10 000转/分离心10分钏，回收沉淀的核酸。）小心去掉上清，敞开管口，将管倒置以使最后残留的液滴流尽。于室温用70乙醇洗涤沉淀及管壁，流尽乙醇，用与真空装置相连的巴其德吸管吸去附于管壁的所有液滴，敞开管口并将管侄置，在纸巾上放置几分钟，以使最后残余的痕量乙醇蒸发殆尽。）用500l含无DNA酶的胰RNA酶(20g/ml）的TE（pH8.0）溶解沉淀，将溶液转到一微量离心管中，于室温放置30分钟。,）加500l含13（w/v)聚乙二醇（PEG 8000）的1.6mol/L NaCl,充分混合，用微量离心机于以12000g离心分钟，以回收质粒。）吸出上清，用400l TE(pH8.0)溶解
10、质粒DNA沉淀。用酚、酚：氯仿、氯仿各抽次。）将水相转到另一微量离心管中，加100l 10mol/L乙醇铵，充分混匀，加倍体积（约1ml）乙醇，于室温放置10分钟，于4以12 000g离心5分钟，以回收沉淀的质粒。）吸去上清，加200l处于4以12 000g离心2分钟。）吸去上清，敞开管口，将管置于实验桌上直到最后可见的痕量乙醇蒸发殆尽。10）用500l TE（pH8.0）溶解沉淀1:100稀释用TE（pH8.0)后测量OD 260，计算质粒DNA的浓度（1OD26050g质粒DNA/ml），然后将DNA贮于20。,七、对重组质粒的检测与目的基因提取,目的基因获取对获得的质粒进行双酶切，获得目
11、的基因与PBR322质粒片段，通过琼脂糖凝胶电泳，由于目的基因与PBR322质粒片段相对分子量不同，在电泳过程中产生不同的条带，通过与已知基因长度的对比，我们可以选出相应的目的基因，接着利用Qiagen纯化柱回收纯化DNA。具体：用3倍体积的特殊高盐溶液于55融化带有目的基因的DNA片段的琼脂糖凝胶块，将DNA释放到水溶液中。然后将其通过Qiagen纯化柱，经过如图结合洗涤洗脱步骤，直接得到纯化的DNA样品。利用核酸探针杂交法鉴定目的基因,八、目的基因与表达载体的组合与导入,表达载体：PBV220,，将PBV220和目的基因用双酶切法处理，退火后连接，构建重组质粒，利用CaCl2法导入到宿主大
12、肠杆菌中，构建工程菌，在培养基中培养，利用干扰素性质鉴定目的工程菌，分离工程菌，扩大培养，提取出质粒，分析质粒稳定性。,干扰素的发酵工艺过程,启开种子 制备种子液 发酵培养 粗提 精提 半成品制备 半成品检定 分装 冻干 成品检定 成品包装,1菌种制备 取70下保存的甘油管菌种（工作种子批），于室温下融化。然后，接入摇瓶，培养温度30，pH7.0，250 r/min活化培养182小时后，进行吸光值测定和发酵液杂菌检查。2种子罐培养 将已活化的菌种接入装有30L培养基的种子罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0，级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧为30%，培养34小时，转入发酵罐中，同时
13、取样发酵液进行显微镜检查和LB培养基划线检查，控制杂菌,3.发酵罐培养 将种子液通入300L培养基的发酵罐中，接种量10%，培养温度30，pH7.0。级联调节通气量和搅拌转速，控制溶解氧30%，培养4小时。然后控制培养温度20，pH6.0，溶解氧60%，继续培养56.5小时。同时进行发酵液杂菌检查，当OD值达9.01.0后，用5冷却水快速降温至15以下，以减缓细胞衰老。或者将发酵液转入收集罐中，加入冰块使温度迅速降至10以下。4.菌体收集 将已降温的发酵液转入连续流离心机，16000 r/min离心收集。进行干扰素含量、菌体蛋白含量、菌体干燥失重、质粒结构一致性、质粒稳定性等项目的检测。菌体于
14、20冰柜中保存时，不得超过12个月。每保存3个月，检查一次活性。,干扰素发酵过程控制,在假单孢杆菌的发酵生产中，菌体在培养1.5小时分裂速度最快，到3.5小时开始下降。而干扰素的迅速合成出现在3.5小时之后，在4小时达到最大，然后由于降解而迅速下降。可见在发酵生产工艺中，假单孢杆菌的生长和干扰素的生产基本处于不相关状态，可采用两段培养的策略进行过程控制。,(1)溶解氧控制 分别在生长阶段和生产阶段采用各自最佳溶解氧浓度，以期提高干扰素的发酵水平。通过级联调节通气量和搅拌转速得以实现。(2).温度控制 假单孢杆菌生长最适温度与产物形成最适温度是不同的。产物合成温度控制在20可以有效防止干扰素-2
15、b的降解，而其最佳生长温度则为30。质粒的稳定性随温度的升高而迅速下降，因此在培养后期降温可以减少目标产物的降解，增加质粒的稳定性。(3)pH值 发酵过程中，pH的变化由工程菌的代谢、培养基的组成和发酵条件所决定。干扰素-的等电点在pH 6.0附近，在低酸性条件下稳定，能耐受pH 2.5的酸性环境。因此可在发酵后期降低pH，从而造成大量蛋白酶失活，减少干扰素-的水解，提高干扰素的积累量。,半成品检定,（1）效价测定 用细胞病变抑制法，以Wish细胞、VSV病毒为基本检测系统，测定中必须用国家或国际参考品校准为国际单位。（2）蛋白质含量测定 福林-酚法，以中国药品生物制品检定所提供的标准蛋白为标
16、准。（3）比活性 效价的国际单位与蛋白质含量的毫克数之比。（4）纯度 电泳纯度用非还原型SDS-PAGE法，银染显色应为单一区带，经扫描仪测定纯度应在95%以上。,（5）相对分子量测定 还原型SDS-PAGE，加样量不地域微克，同时用已知相对分子量的蛋白标准系列做对照，以迁移率为横坐标，相对分子量的对数为纵坐标作图，计算相对分子量。与理论值比较，误差不得高于10%。（6）残余外源性DNA含量测定 用放射性核素或生物素探针法测定，每剂量中残余外源性DNA应低于100pg。（7）残余血清IgG含量测定 在应用抗体亲和层析法作为纯化方法时必须进行此项检定。（8）残余抗生素活性测定 半成品中不应有抗生
17、素活性存在。,（9）紫外光谱扫描 检查半成品的光谱吸收值，最大吸收值应在2802纳米。（10）肽图测定 用CNBr裂解法，测定结果应符合干扰素的结构，且批与批之间应一致。（11）等电点测定 等电聚焦电泳。（12）除菌半成品应做干扰素效价测定、无菌试验和热源质试验。,成品检定,（1）物理性状 冻干品白色或微黄色疏松体，加入注射水后不得含有肉眼可见不溶物。（2）鉴别试验 应用ELISA或中和试验检定。（3）水分测定 用卡氏法，应低于3%。（4）无菌试验 同半成品。,（5）热原质试验 同半成品检定。（6）干扰素效价测定 同半成品检定，效价不应低于标示量。（7）安全试验 取体重为350-400克豚鼠3
18、只，每只腹侧皮下注射量为成人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若豚鼠局部无红肿、坏死、总体重不下降，说明成品合格。取体重18-20克小鼠5只，每只尾静脉注射剂量按人每千克体重临床使用最大量的3倍，观察7天，若动物全部存活，说明成品合格。,1.目的基因的获取为什么用mRNA而不是DNA？,基因组，即某种生物一个细胞内全部的DNA信息。将这些DNA打断，连接到载体上并转入微生物，使这些微生物细胞内含有某生物的全部基因组。那么这些微生物就组成了基因组文库。以上两者包含的都是遗传信息。对于某种生物来说，任何一个细胞的遗传信息都是相同的。cDNA是由细胞内的mRNA通过逆转录的方式获得的，其包含
19、的一个细胞内的表达信息。多细胞生物的不同细胞的表达信息往往是不同的。若将某一个细胞全部的mRNA（又称为这个细胞的转录组）都逆转录成cDNA，再将这些cDNA连接到载体上（基本上不打断）并转入微生物，那么这些微生物就组成了cDNA文库。简单来说，基因组是分子，基因组文库是表示遗传信息的微生物，cDNA文库是表示表达信息的微生物。,2、选择大肠杆菌作为宿主细胞的原因：,第一,大肠杆菌是一种常见菌种.人们对其细胞形态及生理生化特性已经了解比较深入,对于培养基配制与运载体导入的具体技术等方面也就更容易把握.第二,细菌质粒(游离于细菌等微生物细胞质中的小型环状DNA分子)是基因工程常用的运载体(与目的基因结合的工具),而大肠杆菌质粒又是最常用的质粒,因为大肠杆菌质粒上有诸如抗青霉素基因等易于检测的标记基因,并且容易使目的基因在宿主细胞中复制和表达.而最适合大肠杆菌质粒完成使命的场所当然就是它的天然来源大肠杆菌.第三,大肠杆菌是一种典型兼性厌氧行细菌,由于体积小,表面积与体积的比例很大,并且能利用氧气进行彻底生物氧化释放大量能量,因而能够与外界迅速进行物质和能量交换,并在体内迅速转化.这样一来使大肠杆菌新陈代谢极其迅速,就如同一个效率极高的化工厂,而与真正化工厂相比所需反应条件又很温和,容易达到,其经济效益是显而易见的.综合以上考虑大肠杆菌常选为宿主菌用于基因工程也就不足为怪了,
