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1、第十三章 抗原抗体反应,岳 华,抗原与相应抗体的特异性结合反应称为抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)。抗原抗体反应既可在体内作为体液免疫应答的效应机制自然发生，也可在体外作为免疫学实验的结果出现。在体内，可表现为溶菌、杀菌、促进吞噬或中和毒素等作用，有时亦可引起免疫病理损伤，在体外，依相应抗原物理性状(颗粒状或可溶性)以及反应的条件(电解质、补体等)不同，可出现凝集、沉淀、细胞溶解和补体结合等反应。,概述,本章叙述的抗原抗体反应，主要是指抗原和抗体在体外结合所表现的反应。由于抗体主要存在于血清中，并且临床上多用血清做试验，所以体外实验中的抗原抗体反应曾称作血清学
2、反应（serological reaction)。但是随着免疫学的发展，血清学的含义已不能概括目前的研究内容，现在多以抗原抗体反应代替血清学反应一词。,第一节 抗原抗体反应原理,抗原抗体结合反应是抗原决定簇和抗体分子超变区之间的相互作用，是一种分子表面的特异的可逆的弱结合力。这些弱结合力只能在极短距离内才能发生效应。因此抗原抗体结合反应的最重要的先决条件是抗原与抗体间的特定部位的空间结构必须相互吻合，具有互补性;其次，抗原决定簇与抗体超变区必须紧密接触，才能有足够的结合力，使抗原抗体分子结合在一起。,一、抗原抗体结合力,抗原和抗体的结合虽然是互补性的特异性结合，但并不形成牢固的共价键，只是通
3、过非共价键结合，结合方式类似蛋白质和细胞受体或酶与底物之间的结合。抗原与抗体这种弱的结合力涉及下列几种分子间的作用力。,l.静电引力,抗原和抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互的引力，称为静电引力，又称库伦引力。例如，抗体分子上带电荷的碱性氨基酸的游离氨基(-NH3+和酸性氨基酸的游离羧基(COO-可与抗原分子上带相反电荷的对应基团相互吸引。这种引力的大小与两个相互作用基团间的距离的平方成反比。,2.范德华引力,抗原和抗体相互接近时，由于分子的极化作用而出现的引力，称范德华引力。结合力的大小与两个相互作用基团的极化程度的乘积成正比、与它们之间距离的 7 次方成反比，键能约为4.2-12
4、5kJ/mol。这种引力的能量小于静电引力。,3.氢键结合力,供氢体上的氢原子与受氢体原子间的引力。在抗原抗体反应中，羧基、氨基和羟基是主要供氢体，而羧基氧、羧基碳和肽键氧等原子是主要受氢体，能的大小取决于方向即氢键具有高度的方向性，因此范德华力更具有特异性。氢键结合力与供氢体和受氢体之间距离的6次方成反比，键能约209kJ/mol。,4.疏水作用力,两个疏水基团在水溶液中相互接触时，由于对水分子排斥而趋向聚集的力称为疏水作用力，或称为疏水键。当抗原抗体反应时，抗原决定簇与抗体上的结合点靠近，互相间正、负极性消失，由静电作用形成的亲水层立即失去，从而促进抗原与抗体的相互吸引而结合。疏水作用力在
5、抗原抗体反应中的结合是很重要的。提供的作用力最大，约占总结合力的50%。,二、抗原抗体亲和性,抗原与抗体的结合受多种因素的影响，为了较妥当地表示抗原与抗体结合力的大小，在免疫化学中，一般用亲和性 与亲和力两个术语表示。亲和性是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原决定簇之间的相适性而存在着的引力，这是抗原与抗体之间固有的结合力。亲和力是指反应系统中复杂抗原与相应抗体之间的结合能力。,亲和力与亲和性有关，也与抗体的结合价和抗原的有效决定簇数目相关。例如，IgG为两价，其亲和力为单价的l03倍;而IgM为510价;其亲和力为单价的107倍。亲和力越大，抗原抗体结合越牢固。而在单克隆抗体反应系统中，
6、只有某些决定簇起作用，因此，单克隆抗体与相应抗原的亲和力相对较弱。,抗体与抗原结合是可逆的反应，在平衡对其亲和常数 K=抗原抗体复合物浓度 游离抗原浓度游离抗体浓度K代表抗体结合抗原的亲和力。K值大的抗体与抗原牢固结合，不易解离，称该抗体有高亲和力。,三、亲水胶体转化为疏水胶体,抗体和大多数抗原同属蛋白质。在通常的血清学反应条件下均带有负电荷，使极化的水分子在其周围形成水化层，成为亲水胶体，因此蛋白质不会自行凝集出现沉淀。当抗原与抗体结合后，表面电荷减少，水化层变薄;而且由于抗原抗体复合物形成后，与水接触的表面积减少，由亲水胶体转化为疏水胶体。此时在电解质(如NaCl，的作用下，使各疏水胶体之
7、间进一步靠拢、沉淀，形成可见的抗原抗体复合物。,第二节 抗原抗体反应的特点,一、特 异 性特异性(speecificity)是指任何一种抗原分子，只能与由它刺激所产生的抗体结合而起反应的专一性能。特异性是抗原抗体反应的最重要特征之一，是由抗原决定簇和抗体分子超变区之间空间结构的互补性决定的。抗体分子N端可变区形成大小约为3nm1.5nm0.7nm的槽沟，其中超变区氨基酸残基的变异性使槽形状千变万化，只有与其空间结构互补的抗原决定簇才能如楔状嵌入，其关系如锁和钥匙，因此，抗原抗体结合反应具有高度特异性。,这种高度的反应特异性是一切抗原抗体反应的主体，所以在传染病的诊断、防治等医学和生物学领域都已
8、得到了广泛的应用。多数的天然抗原物质的构成十分复杂，如微生物抗原，常含有多个不同的抗原决定簇。如果两种不同的抗原物质具有部分相同或类似结构的抗原决定簇，则可与彼此相应的抗血清出现交叉反应,二、比 例 性,比例性是指抗原与抗体发生可见反应需遵循一定的量比关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见反应。以沉淀反应为例，在加入固定量抗体的一排试管中再依次加入一定体积的递增浓度的抗原进行反应时，发现随着抗原浓度的增加，沉淀很快大量出现，但超过一定范围之后，沉淀速度和沉淀量随抗原浓度增加反而迅速降低，甚至到最后不出现沉淀。沉淀反应的速度反映了参加反应的抗原和抗体浓度的适合程度，适合程度高反应快，反之则慢
9、。通常把最迅速出现沉淀时的抗原抗体的浓度比或量比称为抗原抗体反应的最适比。,实验证明，在同一抗原抗体反应系统中，不管抗原和抗体浓度如何变化，其沉淀反应的最适比始终恒定不变(如表抗原与抗体浓度的最适比始终是1:4)。最适比亦称为抗原抗体反应的等价点。,在最适比反应条件下，抗原抗体几乎全部结合形成沉淀物，上清液中基本无游离的抗原和抗体。当抗原和抗体浓度比超过此范围时，沉淀速度和沉淀最都会迅速降低，甚至不出现沉淀。抗原与抗体分子比例合适的范围称为抗原抗体反应的等价带;因抗原抗体比例不合适而不出现可见反应，称抑制带。其中抗体过量时，称为前带；抗原过量时，称为后带。,抗原抗体反应比例性的机制，可用网格学
10、说加以说明。因为天然抗原大多是多价的，抗体至少为两价，当抗原与抗体在等价带结合时，相互交叉连接成具有立体结构的网格状复合体，形成肉眼可见的沉淀物。当抗原或抗体过剩时，由于过剩方的结合价得不到饱和，只能形成小网格复合物，并存在有较多游离的抗原或抗体。该学说已得到电子显微镜观察的有力支持。但是，当抗原或抗体为单价，不管抗原与抗体的量比关系是否合适，均不能出现可见反应现象。,三、可逆性,可逆是指抗原与抗体结合成复合物后，在一定条件下可解离为游离抗原与抗体的特性。由于抗原抗体反应是分子表面的非共价键结合，所形成的复合物并不牢固，在一定条件下(如低pH、高浓度盐等)可以解离。常用于解离抗原抗体复合物的物
11、质有3mol/L硫氰化钾，7mol/L尿素，pH24、0lmol/L甘氨酸等。解离后的抗原或抗体分子，仍保持原来的理化特性及生物学性状。,四、敏感性,抗原抗体反应具有高度的敏感性，不仅可以定性，而且可以定量。其敏感度大大超过目前所有化学方法。其敏感度因反应种类不同而异。,五、抗原抗体反应的二阶段性,第一阶段为抗原抗体特异性结合阶段，反应速度快，几秒钟或几分钟即可完成，但不出现肉眼可见反应。第二阶段为可见阶段，表现为凝集、沉淀、补体结合等反应，本阶段有两个特点，一是反应进行慢，需要几分钟、几十分钟或更长。其二是受电解质、温度、酸碱度等多种因素影响。,第三节 抗原抗体反应影响因素,影响抗原抗体反应
12、的因素较多，主要有两方面:一方面是受到抗原、抗体的自身因素的影响;另一方面是受到电解质、酸碱度、温度及时间等实验环境因素的影响。,一、应物自身因素,1、抗原 抗原的理化性状、抗原决定簇的数目和种类均可影响血清学反应结果 例如，可溶性抗原与相应抗体反应出现沉淀，而颗粒性抗原与相应抗体反应则出现凝集;单价抗原与抗体结合不出现可见反应;粗糙型细菌在生理盐水中易出现自凝；红细胞与IgG类抗体结合不出现直接凝集等。,抗体是血清学反应中的关键因素，对反应的影响表现在以下三个方面:(1)来源:来自不同动物的免疫血清，其反应性有差异。家兔等大多数动物的免疫血清具有较宽的等价带，通常在抗原过量时才易出现可溶性免
13、疫复合物;马等大动物和人的免疫血清等价带较窄，少量的抗原或抗体过剩，均可形成可溶性免疫复合物;家禽免疫血清不能结合哺乳动物的补体，并且在高盐浓度（80g/L NaCl溶液中沉淀现象明显。单克隆抗体一般不适用于沉淀反应或凝集反应。,2、抗体,(2)特异性与亲和力:,特异性和亲和力是影响血清学反应的两个关键因素，它们共同影响试验结果的准确程度。免疫动物早期获得的抗血清特异性较好，但亲和力低;后期获得的抗血清一般亲和力较高，但长期免疫易使免疫血清中抗体的类型和反应性变得更为复杂。因此，用于诊断的试剂必须尽量选用特异性高、亲和力强的抗体，才能保证和提高试验结果的可靠性。,（3）浓度:抗体的浓度往往是与
14、抗原相对而言。合适的浓度才出现明显的反应现象。因此许多试验应进行抗体预滴定，找出最适反应浓度。,二、环境条件,l.电解质 抗原抗体结合后由亲水性变为疏水性，此时易受电解质影响，如有适当浓度电解质存在，就会使抗原抗体失去一部分电荷而相互凝集或沉淀，出现可见反应;若无电解质存在，则不出现可见反应。通常在血清学试验中，以85g/LNaCl溶液作为抗原抗体的稀释液及反应液，其中Na+和Cl-可分别中和胶体颗粒上的电荷，使胶体颗粒的电势下降，形成可见的沉淀物或凝集物。但如果电解质浓度过高，则会出现非特异性蛋白质沉淀，即盐析。补体参与的溶细胞反应，除需要等渗的NaCl溶液外，还需适虽的Mg2+和Ca2+离
15、子参与。,2.酸碱度 合适的pH是抗原抗体反应的必要条件之一。血清学试验一般以pH6-9为宜，超出此范围可影响抗原和抗体的理化性质，导致假阳性或假阴性结果。当pH为3左右时，接近细菌抗原的等电点，可出现非特异性酸凝集，造成假象。,3.温度 抗原抗体反应一般在15一40范围内均可进行，最适温度为37。在此范围内温度越高，分子运动速度加快，增加抗原抗体接触机会，反应速度越快，但亦容易引起复合物解离;温度越低，反应速度缓慢，但抗原抗体结合牢固，易于观察。某些特殊的抗原抗体反应需要特定的温度，如冷凝集素在4时与红细胞结合，20以上反而解离。,4、作用时间,抗原抗体反应应有足够的时间，不同反应时间不同。
16、,此外，抗原抗体反应在液相中反应时，适当振荡与搅拌，也可促进抗原抗体分子的接触，加速反应。,第四节 抗原抗体反应类型,现代免疫学技术发展很快，在经典血清学试验方法基础上，新的免疫学测定方法日益增多，使方法的敏感性、特异性和稳定性都有不同程度的提高，检测目的物也越来越多。根据抗原抗体反应所产生的现象和结果的不同，把抗原抗体 反应分为5种类型:,可溶性抗原与相应抗体结合所产生的沉淀反应(precipitation)；颗粒性抗原与相应抗体结合所发生的凝集反应(aggluhnation);抗原抗体结合后激活补体所致的细胞溶解反应(cytolyssis)细菌外毒素或病毒与相应抗体结合所致的中和反应(neutralization);免疫标记的抗原抗体反应。每种反应类型都包括若干实验技术。,
