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1、微流控芯片,微流控芯片实验室,把各种基本操作单元(细胞培养、分选、裂解,样品制备、反应、分离、检测等)集成到一块几平方厘米的芯片上;由微通道形成网络，以可控流体贯穿整个系统;取代常规生物或化学实验室的各种功能。微流控芯片实验室的基本特征和最大优势是多种单元技术在微小平台上的灵活组合和规模集成。,微流控芯片实验室(lab-on-a-chip),又称微全分析系统(micro total analytical system,TAS)或微流控芯片(microfluidic chips)，原型是20世纪90年代初开展的芯片毛细管电泳，是21世纪最为重要的前沿技术之一采用微电子工业和半导体制造业中的一些精
2、细加工工艺，在硅片、玻片和塑料等表面经过必要的化学处理后，加工出微细（微米尺寸）结构，制作成一块几平方厘米的芯片，化学或者生物化学的实验过程可微缩到该芯片上进行，用于生物样品分离、反应、分析，是一种新型的生物芯片。样品用量极微少，分析速度很快，得到的信息量可以比常规实验室多几个数量级，它不仅可用于分析，生化反应，而且还可用于细胞培养，在临床诊断，药物筛选和生命科学的其他领域都有广泛应用。,微流控分析芯片实验室的结构特点,芯片实验室由进样系统、样品过滤和抽提机械、流体系统、阀系统、电泳等分离系统以及检测系统等部分组成，大体可分为三个部分：不同功能的微流控芯片、芯片微流体运行控制装置及信号采集的控
3、制与检测装置。,提高分辨率-梯度洗脱技术,1.0%MCwithout EtBr,0.3%MCwith EtBr,detection,Buffer,Sample,Sample waste,Analysis,Separation of x174-Hae Digest,Connector made for PCR application,the complete PCR is done in the chip and connector:,微流控芯片与微阵列芯片有显著的不同，它主要依托分析化学和生物学，芯片的构造为微管道网络结构，通过微管道中的流体控制来实现分离和分析的目的，一张芯片可重复使用数十至
4、数千次；而微阵列芯片主要依托生物学，通过生物分子之间的杂交实现检测的目的，一张芯片一般只使用一次。,微流控芯片的制作,加工技术起源于微电子工业微机电加工技术，即集成电路芯片制作的光刻和蚀刻技术，微管道宽度和深度为微米级，比集成电路芯片的大，但加工精度要求则相对较低。基片材料应具有良好的电绝缘性、散热性、光学性能和可修饰性，可产生电渗流，能固载生物大分子，对检测信号干扰小或无干扰；与芯片实验室的工作介质之间要有良好的化学和生物相容性，不发生反应。基片材料从硅片发展到玻璃，石英，有机聚合物等。微米尺寸结构，要求在制备过程中必须对环境进行严格认真的控制，包括空气湿度，空气温度，空气及制备过程中所使用
5、的各种介质中的颗粒密度，要求在洁净室中完成。,微流控芯片的基本加工,光刻和蚀刻技术，用光胶、掩膜、和紫外光进行微制造，由薄膜沉积，光刻和蚀刻三个工序组成。光刻前首先要在基片表面覆盖一层薄膜，薄膜的厚度为数埃到几十微米，称为薄膜沉积。然后在薄膜表面用甩胶机均匀地覆盖上一层光胶，将掩膜上微流控芯片设计图案通过曝光成像的原理转移到光胶层的工艺过程称为光刻。光刻的质量则取决于光抗蚀剂（有正负之分）和光刻掩膜版的质量。掩膜的基本功能是基片受到光束照射（如紫外光）时，在图形区和非图形区产生不同的光吸收和透过能力。,微流控芯片制备,热压法：将聚合物载体调至与模具相对应的位置后，移入加热装置中，温度升高是聚合
6、物发生玻璃化，随之在两者之间施压，降温，撤压，脱模操作，微通道结构便呈现在载体上，接着进行盖片与载体的封接,蚀刻是在光刻过的基片上可通过湿刻（wet etching）和干刻（dry etching）等方法将阻挡层上的平面二维图形加工成具有一定深度的立体结构。选用适当的蚀刻剂，使它对光胶、薄膜和基片材料的腐蚀速度不同，可以在薄膜或基片上产生所需的微结构。复杂的微结构可通过多次重复薄膜沉积光刻蚀刻这三个工序来完成。微流控基片通过预处理，涂胶，前烘，曝光，显影及坚膜，去胶等步骤后，材料上呈现所需要的图形，即通道网络。,盖板与微流控芯片基片的封接,基片和盖板封接后形成封闭的小池，可用来储存试剂或安装电
7、极。试剂必须要通过芯片上的小孔才能进入通道网络，所以通过微加工技术所制得的具有不同结构和功能单元的微流控芯片基片，在与盖板封接之前必须在微通道末端打一小孔，组装成微流控成品才能使用。小孔可钻在基片上，也可钻在盖板上。玻璃芯片的打孔方法包括金刚石打孔法，超声波打孔法，和激光打孔法。打孔后一定要将芯片制作和打孔过程中所残留的小颗粒、有机物和金属物等清除干净，包括化学清洗，提高芯片表面平整度，以保证封接过程顺利进行。,微流体的控制与驱动,微流控芯片是通过微细加工技术将微管道，微泵，微阀，微储液器，微电极，微检测元件和连接器等功能元件像集成电路一样，使它们集成在芯片材料（基片）上的微全分析系统。面积一
8、般约为几平方厘米。微流体的可控性是微流控芯片区别与点阵式芯片的最本质特征，也是其被称为“主动式”芯片的原因。微流体控制是微流控芯片实验室的操作核心，涉及的进样，混合，反应，分离等过程无一不是在可控流体的运动中完成，阀则是流体控制的核心部分。基本的微流控技术有驱动（微泵）控制，微阀控制，芯片微通道构型控制，通道表面性质控制等，微流体的控制与驱动以电渗控制和微阀操作控制技术为主，微系统的层流效应与分子扩散效应也起着十分重要的作用。,电渗控制是指在电场作用下，微通道中的液体沿通道内壁作定向移动的现象。影响电渗流的因素包括通道表面的组成，缓冲液性质，外加电场强度，温度等，通过对这些影响因素的调节，改变
9、通道内壁表面的电荷性质和密度，调节微通道网络中不同节点的电压值，就可控制电渗流即微流体的迁移速度和运行方向，完成较为复杂的混和，反应和分离等操作。Baker等报道利用聚合高分子电解质涂层，进行聚苯乙烯和丙烯酸为基质的微芯片通道内表面的涂层改性，从而控制微系统中液流的流动方向，甚至可以在一个通道内实现两个流向相反的液流的同时操作。,凡是能控制微通道闭合和开启状态的部件，并具有低泄漏，低功耗，响应快，线性操作等性能，均能作为微流控芯片中的微阀。微反应器是一种单元反应界面为微米级的微型化学反应系统，随着微反应器线性尺度的减小，对化学反应非常重要的浓度，压力，密度，温度等梯度很快得到增加，从而使混合和
10、反应时间缩短到毫秒级以下。生物样品分析如DNA杂交，酶反应，蛋白折叠等均涉及到样品的快速均匀混合，反应物的混合程度直接影响着反应的速率和产物的得率；微通道中通道较短，体积较小，反应时间很短，反应相对难以完成，所以快速均匀混合显得尤其重要，因此微混合器也就成为微流控集成设计的重要组成部分。,进样及样品前处理,微流控芯片分析系统的尺寸微小，内部进行的是体积在皮升至纳升级的操作，与其联系的外部分析对象或样品储存系统则通常是体积在微升、毫升以上。这种微观系统和宏观系统的衔接决定了微流控芯片系统样品引入的特殊性。液态样品进样方式取决于其样品源的内置与外置。一般都采用样品源内置的方法，即芯片上有一个储液池
11、来容纳样品源，因其与微通道直接相连，进样时只需要对样品施加压力或电动力即可，进样相对简单；而外置的样品源则需要导管，并要求导管与芯片接口嵌合极佳，一般较难实现。固态样品需进行流体化后才能进样。细胞样品通常采用低压驱动以防止细胞破裂。,信号采集的控制与检测,光学检测法：激光诱导荧光，化学发光和紫外吸收等光学检测器至今仍是主流检测手段。激光诱导荧光是目前最灵敏的检测方法之一。微流控的主要研究对象核酸、蛋白质、氨基酸等可以通过荧光标记进行检测，因此，激光诱导荧光监测器是一种应用最早，并且至今仍沿用的光学检测器。其他检测方法还有电化学的检测，质谱检测，光谱检测以及一些基于生物反应器的检测。,操作程序简
12、述,不同功能的微流控芯片的制作样品处理 利用不同的方法如微过滤或双向电泳分离细胞、DNA等样品；生物化学反应 依照微流控芯片的功能类型，在控制温度的微量反应池中进行PCR扩增DNA、酶反应或免疫反应；结果检测 经芯片杂交后，检测激光激发的荧光信号或酶的显色反应。,芯片实验室应用和发展,核酸的扩增，分离及测序仍是微流控芯片应用的主要领域。最早的关于核酸的应用是在微流控芯片上实现DNA酶解和限制性片断电泳，后来又发展了集成细胞或细菌裂解，PCR扩增和电泳分离的微流控芯片检测。在PCR技术上，PCR体系的反应体积也从微升级降到纳升级，极大地缩短了反应时间；,1998年，美国Nanogen公司的Che
13、ng等人在Nature的Biotechnology杂志上发表了关于芯片实验室的论文。他们通过芯片组合将样品制备，生化反应和结果检测三个部分的工作依次完成，这是世界上第一个严格意义上的微型全分析系统操作。通过该系统将大肠杆菌从人的血细胞和大肠杆菌混合液中分离出来，富集后在芯片上进行裂解细菌，释放出核酸物质，再进行杂交检测。原始样品进入阵列后，微电极上施加特定频率的交流电信号，所需的大肠杆菌细胞受到正向介电电泳力，被吸附在微电极周围区域，而人的血细胞受到负向介电电泳力被推离微电极区域，即悬浮在溶液中。在流动相的清洗作用下便可除去人的血细胞，留下所需的大肠杆菌细胞。然后，在微电极上施加高压脉冲电信号
14、，使得吸附在微电极周围区域的大肠杆菌细胞破裂，释放质粒DNA，基因组DNA和RNA等核酸物质，从而实现从原始样品到核酸的样品制备过程。生化反应和结果检测也在微电极阵列上完成。单个微电极上可以固定不同的探针，通过微电极的选通或是关闭，以捕获和检测相对应的核酸物质。,用于RNA病毒的检测芯片：温控单元和温度传感部件均置于反应室中，由铂金制成，不同的温控分别完成逆转录和PCR；而控制单元则由微阀和微泵组成，以控制流体运输。利用该装置成功检测了II型登革热病毒和肠道病毒EV71。,RT-PCR芯片实验室示意图。摘自Nucleic Acids Research,2005,Vol.33,No.18 e15
15、6,微流控芯片对单个细胞及胞内的微量物质的分析与检测：在同一芯片上集成细胞培养、运输、清洗、破碎、样品纯化和电泳分离等操作单元。构建不同尺度且相对封闭的二维或三维网络结构，避免外界的污染。芯片材料多采用聚二甲基硅氧烷PDMS，具有良好的生物相容性，对气体也有一定的通透性，有利于细胞培养中氧气和二氧化碳的交换。培养多采用灌流式，将细胞悬液注入微培养室，待细胞贴壁后，将培养液连续灌入培养室，即时更新营养物质。利用微流控芯片进行细胞培养时，要最大限度地降低流体剪切力对细胞状态的影响。利用微流控芯片能实现对细胞的分选，细胞裂解，从而对细胞分化增殖状态，细胞应激反应，细胞膜功能，离子通道，细胞间相互作用
16、等多方面进行研究。,研究药物诱导肿瘤细胞凋亡及细胞凋亡相关的细胞膜功能的变化：利用芯片通道内的层流混合和分流，结合芯片浓度梯度生成器，将药物浓度生成、细胞培养，细胞刺激，细胞标记及细胞响应的检测过程集中到芯片上，对不同浓度的阿霉素诱导肝癌细胞HepG2的凋亡过程进行监测。首先将HepG2细胞导入芯片上的培养单元，细胞贴壁后，加入药物溶液作用一定时间，再加入荧光标记试剂进行细胞标记，然后加入冲洗液进行细胞标记后洗涤，最后置于显微镜下检测。,细胞凋亡检测集成化微流控芯片示意图。各试剂的入口和芯片结构单元如图所示。摘自Electrophoresis 28:1146-1153,2007,微流控芯片在小
17、分子领域的应用尚处于起步阶段，在毛细管电泳上分离小分子，小离子，和拆分手性分子的经验正被迅速移植到芯片上，其中代谢产物的分析是研究的重点。复杂的代谢过程可在芯片上模拟，代谢产物可是模拟的终端出口。下游则是将复杂的代谢产物的在同一块芯片上样品进行处理以及分离和检测。芯片实验室可以应用于疾病诊断、药物合成与筛选、食品分析、环境监测，毒品检测等众多领域。,组合化学技术与高通量筛选技术的联用是新药研究中先导化合物发现的重要手段。其中的液相组合平行合成方法所需的反应器数目根据反应物可能的组合数目来决定，而芯片系统单个反应器的微型化则可消除平行合成由反应器数目众多所带来的缺点。,三维2x2平行合成芯片实验
18、室示意图。芯片的三层结构如图所示，A，B，C，D分别为起始材料的进样口，AC，AD，BC，BD分别为产物出口。摘自Lab Chip 2:188-192,2002,三张玻璃基质的微流控芯片：上下两层的微流控芯片分别有相应的微结构，微通道的宽度和深度分别为240和60微米，而中间的一层仅在必要的连接上下两层的地方钻孔。上下两层的玻璃基质均为30 x 70 x 0.7 mm，而中间层玻璃基质为30 x 70 x 0.2 mm。整套系统共有四个进口和四个出口。试剂对（A，B）和（C，D）代表起始分子文库，每个试剂的流向都分为两道，最终混合成四种不同的组合即AC，AD，BC和BD。试剂A和B的微通道设计在下层的芯片上，而试剂C和D的微通道设计在上层芯片上，这样通道之间不会存在交叉污染。利用这一装置，A和B中的物质扩散到C和D中，并与C和D中的物质发生反应。从AC，AD，BC，BD各孔中收集终反应产物。,利用微流控芯片研究遗传性疾病和致病基因：包括点突变及SNP，基因大片段缺失、基因重排、甲基化，短串联重复序列多态性等的研究。微流控芯片在蛋白质领域的应用显然不足，蛋白质吸附问题也因为芯片表面的多样性变得复杂。,
