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1、第六章微生物生长及其控制,第一节 测定生长的方法,1.直接计数法（全数法）计数器计数法：血球计数板 细菌计数板 涂片染色计数法 比浊法,2.间接计数法（活菌计数法）,平板菌落计数法 液体稀释培养测数（Most Probable Number method,MPN法）薄膜过滤计数法,过滤计数,3.测定细胞物质量,干重法 含氮量测定法 DNA测定法 其他生理指标测定法：物质的消耗 产生量 对氧的吸收 发酵糖产酸量 二氧化碳的释放量等,微生物比浊法,第二节微生物生长的规律,微生物的生长与繁殖 微生物生长(Growth)：是指细胞物质有规律地、不可逆增加的生物过程。微生物繁殖(Reproduction
2、)：是微生物生长到一定阶段由于细胞内各种细胞结构的复杂和重建导致产生新的生命个体，即引起生命个体数量增加的整个生物学过程。,一、微生物的个体生长与繁殖,1、细菌的个体生长与繁殖 单细胞原核微生物持续生长直至分裂成两个新的细胞，这个过程称为二等分裂。杆状细菌如大肠杆菌在培养过程中，能观察到细胞延长至大约为细胞最小长度的2倍时，处于细胞中间部位的细胞膜和细胞壁从两个相反的方向向内延伸，逐渐形成一个隔膜，直至2个子细胞被分割开，最终分裂形成2个子细胞。2、细菌拟核DNA 的复制与分离 细菌的拟核（nucleoid）即染色体（bacterial chromosome）是一环形双链DNA分子。细菌细胞在
3、生长过程中，其双链环形DNA分子在一个特定位置上起始复制，该位置称为复制原点，也称复制起点。复制原点是一约由300个碱基组成的特异序列，它能被特异的起始蛋白所识别；DNA复制从原点开始，向两个相反的方向延伸，最终形成两个子染色体DNA分子。在细胞分裂形成的两个子代细胞中，分别含有一个遗传信息完整的拟核。,细菌生长曲线的分期,滞留适应期 对数生长期 稳定生长期 衰亡期,1.滞留适应期（Lag phase）,特点：1）细菌数量不增加或增加很少，代谢活跃；2）细胞内RNA，尤其是rRNA的含量很高，细胞的嗜碱性强；3）细胞体积增大，拉长；4）细胞内的代谢活力强，特别是合成一些必需的酶类；5）抗性有所
4、降低，对不良环境因素表现很敏感。,2.对数期（Log phase）,特点 1）代时最短，生长速度最快；2）细胞稳定（平衡）生长：细胞内各种物质按比例生长，菌体成分均匀；3）酶活性高，代谢稳定，菌体大小基本一致。,3.稳定期（Stationary phase）,特点：1）生长速度为零，新生=死亡，达到动态平衡；2）活菌数的总量达到最大值；3）胞内的储藏物开始形成（如肝糖粒、脂肪粒等）；4）某些芽孢菌的芽孢开始形成；5）某些细菌过量积累次级代谢产物，如抗生素、维生素等。,4.衰亡期（Death phase）,特点：1）生长速率负增长；2）细胞形态多样，出现畸形，形成衰退型；3）蛋白水解酶活跃，出现
5、细胞自溶现象；4）芽孢细菌芽孢大量释放。,第三节影响微生物生长的主要因素,温度氧气pH,一 些 基 本 术 语,灭菌(Sterilization)：指利用某种杀死物体中包括芽孢在内的所有微生物的一种措施.抑制(inhibition)：是在亚致死剂量因子作用下导致微生物生长的停止，但在移去这种因子后生长仍可以恢复的生物学现象。,消毒(Dis-infection)是利用某种方法杀死或灭活物质或物质中所有病原微生物的一种措施,它可以起到防止感染或传播的作用.,温度,最低生长温度:指微生物能进行繁殖的最低温度界限。最适生长温度：指使微生物达到最大生长速度的温度。最高生长温度：指微生物能生长繁殖的最高温
6、度界限。致死温度：是指能使 微生物死亡的最低温度界限。致死时间：在一定温度下杀死微生物所需要的最短时间。,温度对微生物的影响,利用高温灭菌的方法,干热灭菌 湿热灭菌 巴斯德灭菌,干热灭菌,干热灭菌法：160处理12h。适用于玻璃器皿、金属用具等耐热物品的灭菌。优点：可保持物品的干燥。灼热灭菌法：常用于金属性接种工具、污染物品及实验材料等废弃物的处理。,湿 热 灭 菌,煮沸消毒法：100，15min以上。高压蒸汽灭菌法：1.05kg/cm2（15b/in）的蒸汽压，121处理1530min。间隙灭菌法：用流通蒸汽反复多次处理的灭菌法。,高压蒸汽灭菌,巴斯德消毒法：用较低的温度（如6263，30m
7、in）处理牛奶、酒类等饮料，以杀死其中的病原菌如结核杆菌、伤寒杆菌等，同时又不损害营养与风味的方法。,pH对微生物生长的影响,由于氢离子与细胞膜上的酶相互作用,氢离子也影响细胞壁中的酶活性;pH值影响培养基中有机化合物的离子化,从而间接影响微生物;pH值影响营养物质的溶解度;pH影响代谢产物的积累;抑制杂菌生长.,湿度、渗透压和水活度,湿度一般是指环境空气中含水量的多少，有时也泛指物质中所含水份的量。一般的生物细胞含水量在7090%。湿润的物体表面易长微生物，这是由于湿润的物体表面常有一层薄薄的水膜，微生物细胞实际上就生长在这一水膜中。放线菌和霉菌基内菌丝生长在水溶液或含水量较高的固体基质中，
8、气生菌丝则曝露于空气中，因此，空气湿度对放线菌和霉菌等微生物的代谢活动有明显的影响。,氧,根据氧与微生物生长的关系可将微生物分为：好氧性微生物 微好氧性微生物 氧的忍耐型微生物 兼性厌氧性微生物 专性厌氧性微生物,辐射对微生物的影响,化学药物,1.重金属盐类：0.1%HgCl2、AgNO3等 2.氧化剂：KMnO4、H2O2、Cl2等 3.还原剂：甲醛等 4.表面活性剂：乙醇、酚、来苏儿等 5.其它化学药物：1%KOH、1%H2SO4、结晶紫等 6.化学疗剂：抗生素、抗代谢物,化疗药物发展简史,古希腊人用雄蕨（male fern）作为肠道驱虫药 古印度人用大风子(chaulmoogra)治疗麻
9、风病 我国古代人用豆腐霉治疗疖、痈也在史书上有所记载 16世纪水银被用于治疗梅毒 17世纪金鸡纳树皮用于治疗疟疾.,1935年德国学者Domagk报道红色染料百浪多息(Prontosil)对链球菌及其他细菌感染的小鼠具有保护作用 1929 Fleming（1929）发现了青霉菌培养液的抗菌作用 1940年Florey和Chain继Fleming（1929）之后，提炼青霉素结晶作为细菌感染性疾病的化学治疗，由此开创了抗生素“黄金年代”,最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration,MIC）在体外培养细菌18-24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度 最低
10、杀菌浓度（minimum bactericidal concentration,MBC）能够杀灭培养基内细菌或使细菌数减少99.9%的最低药物浓度称为最低杀菌浓度,抗生素后效应（post antibiotic effect，PAE）指细菌与抗生素短暂接触，当抗生素浓度下降，低于MIC或消失后，细菌生长仍受到持续抑制的效应,抗菌药物的作用机制,干扰病原体的生化代谢 影响其结构和功能 失去正常生长繁殖的能力 抑制或杀灭病原体,(一)干扰细菌细胞壁的合成(inhibition of synthesis of cell wall)（二）改变胞浆膜的通透性(interfered the permeabi
11、lity of the plasmamembrane)（三）抑制蛋白质的合成(modification of protein synthesis)（四）影响核酸代谢(modification of nucleic acid/DNA synthesis)(五)影响叶酸代谢(interfere the folic acid metabolism),(一)干扰细菌细胞壁的合成(inhibition of synthesis of cell wall),细菌细胞壁的特点：细菌细胞壁位于细胞浆膜之外，人体细胞不具有 维持细菌细胞外形完整的坚韧结构，细胞壁的主要成分为肽聚糖又称黏肽 革兰阳性菌细胞壁坚厚，
12、多糖肽含量大约50%-80%，菌体内渗透压高 革兰阴性菌细胞壁比较薄，多糖肽仅占1%-10%，类脂质较多，占60%以上。菌体内渗透压低。革兰阴性菌细胞壁与阳性菌不同。在肽聚糖层具有脂多糖，外膜及脂蛋白等特殊成分。外膜在多糖肽层的外侧，由磷脂、脂多糖及一组特异蛋白组成，它是阴性菌对外界的保护屏障,青霉素类、头孢菌素类通过抑制细胞壁的合成而发挥作用 作用机制之一是与青霉素结合蛋白（PBPS）结合，抑制转肽作用，阻碍了多糖肽的交叉联结，导致细菌细胞壁缺损，丧失屏障作用，使细菌细胞肿胀、变形、破裂而死亡.,（二）改变胞浆膜的通透性(interfered the permeability of the
13、plasmamembrane),多肽类抗生素如多粘菌素E(polymyxins)，含有多个阳离子极性基团和一个含有脂肪酸直链肽，其阳离子能与胞浆膜中的磷脂结合，使膜功能受损 抗真菌药物多烯类的制霉菌素，两性霉素B能选择性地与真菌胞浆膜中的麦角固醇结合，形成孔道，使膜通透性改变，细菌内的蛋白质、氨基酸、核苷酸等外漏，造成细胞死亡,（三）抑制蛋白质的合成(inhabitation of protein synthesis),细菌核糖体的沉降系数与人体细胞的核糖体的沉降系数不同 细菌：70S，可解离为50S亚基和30S两个亚基 人体：80S，可解离为60S和40S两个亚基 人体细胞的核糖体与细菌核糖
14、体的生理、生化功能不同 抗菌药物能选择性影响细菌蛋白质的合成而不影响人体细胞的功能 抑制蛋白质合成的药物分别作用于细菌蛋白质合成的起始、肽链延伸及合成终止三阶段,（四）影响核酸代谢(modification of nucleic acid/DNA synthesis),利福平特异性地抑制细菌DNA依赖的RNA多聚酶，阻碍mRNA的合成 喹诺酮类抑制DNA回旋酶(gyrase)，抑制细菌的DNA复制和mRNA的转录 核酸类似物抗病毒药物阿糖腺苷(vidarabine)、更昔洛韦（ganciclovir）等抑制病毒DNA合成的酶，使病毒复制受阻，发挥抗病毒作用。,(五)影响叶酸代谢(interfe
15、re the folic acid metabolism),细菌不能利用环境中的叶酸，而必须利用对氨苯甲酸和二氢蝶啶在二氢叶酸合成酶的作用下合成二氢叶酸，再经二氢叶酸还原酶的作用形成四氢叶酸 磺胺类和甲氧苄啶可分别抑制叶酸合成过程中的二氢叶酸合成酶和二氢叶酸还原酶，影响细菌体内的叶酸代谢，导致细菌生长繁殖不能进行 抗结核药对氨基水杨酸竞争二氢叶酸合成酶，抑制结核杆菌的生长繁殖,（一）细菌耐药性的产生,细菌耐药性(bacterial resistance)又称抗药性是细菌对抗生素不敏感的现象 细菌在自身生存过程中的一种特殊表现形式 微生物接触到抗菌药，也会通过改变代谢途径或制造出相应的灭活物质抵
16、抗抗菌药物，产生了耐药性,（二）耐药性的种类：,固有耐药（intrinsic resistance）（天然耐药性）获得性耐药（acquired resistance）细菌固有耐药性的特点：是由细菌染色体基因决定 代代相传 不会改变,（三）耐药的机制,1.产生灭活抗菌药物的酶 2.抗菌药物作用靶位改变 3.改变细菌外膜通透性 4.影响主动流出系统,1.产生灭活抗菌药物的酶,-内酰胺酶：（-lactamase）由染色体或质粒介导。对-内酰胺类抗生素耐药主要是细菌产生的-内酰胺酶使-内酰胺环裂开而使该抗生素丧失抗菌作用 氨基苷类抗生素钝化酶：（aminoglycoside modifying enz
17、yme）细菌在接触氨基苷类抗生素后产生钝化酶使后者失去抗菌作用 其它酶类：细菌可产生氯霉素乙酰转移酶（chloramphenicol acetyltransferase,CAT）灭活氯霉素；产生酯酶（esterase）灭活大环内酯类抗生素；金黄色葡萄球菌产生核苷转移酶（nucleotidyltransferase）灭活林可霉素,2.抗菌药物作用靶位改变,由于与抗生素结合靶蛋白的改变 细菌与抗生素接触之后产生一种新的靶蛋白 靶蛋白数量的增加,3.改变细菌外膜通透性,细菌接触抗生素后，可以通过改变通道蛋白（porin）的性质和数量来降低细菌的膜通透性,4.影响主动流出系统,某些细菌能将进入菌体的药
18、物泵出体外，这种泵因需能量，故称主动流出系统(active efflux system)流出系统由三个蛋白组成，即转运子、附加蛋白和外膜蛋白，三者缺一不可，又称三联外排系统（tripartite efflux system）,第四节微生物培养,微生物纯培养技术,纯培养(Pure culture)：微生物学中将在实验室条件下从一个细胞或一种细胞群繁殖得到的后代称为纯培养,获得纯培养的技术,稀释平板分离法 平皿划线分离法 单细胞挑取法 利用选择性培养基分离法 富集培养 二元培养：是纯培养的一种特殊形式，主要用于分离寄生微生物的方法。共培养(Coculture),分批培养与连续培养,一）分批培养 在
19、一个相对独立密闭的系统中，一次性投入培养基对微生物进行接种培养的方式一般称为分批培养(batch culture)。由于培养系统的相对密闭性，故分批培养也叫密闭培养（closed culture）。如在微生物研究中用烧瓶作为培养容器进行的微生物培养一般是分批培养。采用分批培养方式时，随着培养时间的延长，由于系统相对密闭性，被微生物消耗的营养物得不到及时地补充，代谢产物未能及时排出培养系统，其它对微生物生长有抑制作用的环境条件得不到及时改善，使微生物细胞生长繁殖所需的营养条件与外部环境逐步恶化，从而使微生物群体生长表现出从细胞对新环境的适应到逐步进入快速生长，而后较快转入稳定期，最后走向衰亡的阶
20、段分明的群体生长过程。,连续培养方式,恒浊器法(Turbidostat)：指不断调节流速而使细菌培养液保持恒定的连续培养方法；主要用于获得大量菌体或与菌体相平行的代谢产物。恒化器法(Chemostat)：指控制恒定的流速，使由于细菌生长而耗去的营养物质及时得到补充，培养基中营养物浓度基本恒定，从而保持细菌的恒定生长速率。,同步培养,通过机械方法和调控培养条件使某一群体中的所有微生物个体细胞尽可能处于同一生长和分裂周期中，从而使细胞群体中各个体处于分裂步调一致的生长状态，这种生长状态称为同步生长(synchronous growth)。,获得微生物同步生长的方法,主要有以下两类：机械筛选法。这一
21、方法是利用处于同一生长阶段细胞的体积与大小的同一性，用过滤、密度梯度离心或膜洗脱等方法收集同步生长的细胞。诱导法。这一方法是用理化条件（药物、营养物、温度、光照等）人为诱导控制微生物细胞群体处于某同一生长发育阶段，以获得同步生长细胞。,微生物营养生长,恒化培养,第五节有害微生物的控制,（一）抗药性 微生物对以抗生素为主的药物的抗性简称为抗药性。当某种抗生素长期作用于一些敏感（病原）微生物时，微生物通过遗传适应，对特定抗生素表现出抗药性。抗药性的途径：1抗性细胞产生酶，使药物失去活性 2修饰和改变药物作用靶位 3改变细胞对药剂的渗透性与增强外排作用 4形成救护途径,微生物抗药的机理遗传变异 发生突变 染色体重组 改变遗传性 自然选择,杀菌、抑菌、溶菌,致死效应,微生物的耐药性,液体测定杀菌效果,固体测定杀菌效果,抗生素的作用机制,抗生素作用范围,青霉素的改造,细菌滤器,
