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1、第二章 微生物的纯培养和显微技术,微生物的分离和纯培养,显微镜和显微技术,1微生物的分离和纯培养,无菌技术,用液体培养基分离、培养,用固体培养基分离、培养,二元培养物分离、培养,选择培养分离,单孢子分离,微生物分离方法,微生物的保藏技术,微生物纯种分离,将多种混杂微生物，经某种技术或方法分离成纯种的过程,纯培养（pure culture）,在适宜条件下培养纯种获得的培养物（群体）,单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞群体，称为菌落(colony)。,菌落,一个菌落是一个纯种，也是一个纯培养；单个微生物只在固体培养基上形成菌落；在液
2、体培养基中不会形成菌落,同一细菌在不同的培养平板上形成不同的特征菌落,一、用固体培养基（营养琼脂平板）分离纯种,微生物样品,多种混杂,某种方法,分散成单个微生物,平板,培养,单菌落,每个菌落为纯种（纯培养）,单菌落转接培养,纯种（纯培养）,（一）、微生物纯种分离的原理和方法,（二）、纯种平板分离的不同方法,从土壤中分离纯微生物,104/ml,103/ml,102/ml,101/ml,涂布平板法,稀释倒平板法,1、涂布平板法（spread plate method),2、稀释倒平板法（倾注平板法）（pour plate method),分区划线法（蛇形线法）操作图,第一区划线,灭菌接种环,第二区
3、划线,灭菌接种环,第三区划线,灭菌接种环,3、平板划线法（streak plate method）,分区划线法适用范围：适用于浓度较大的样品,连续划线法操作图,连续划线法适用范围：适用于浓度较小的样品,培养严格厌氧微生物,4、稀释摇管法（dilution shake culture method),二、用液体培养基分离纯化培养,个别细胞较大的细菌 原生动物、藻类,接种物液体培养基顺序稀释法分离,营养琼脂平板不能长菌落,如何分离纯培养？,培养物在液体培养基中进行高度顺序稀释，如果经稀释后的同一稀释度的大多数（95%以上）试管中没有微生物生长，有微生物生长的试管得到的培养物可能就是纯培养物。,上节
4、课知识回顾,微生物分离纯化方法,用固体培养基分离、纯培养,稀释倒平板法,涂布平板法,平板划线法,稀释摇管法,用液体培养基分离、纯培养,三、单细胞（单孢子）分离,采用显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以得到纯培养，称为单细胞（单孢子）分离法。,个体较小的微生物需采用显微操作仪,分离难度与细胞或个体的大小成反比,营养琼脂平板上不能形成菌落,较大的微生物可使用毛细管提取,Each colony was examined microscopically,四、选择培养分离,创造适于目的微生物生长条件,原理,促使目的微生物快速生长呈优势菌,抑制非目的微生物生长,从混杂微生物中分离目的
5、微生物,1、利用选择培养基进行直接分离,选择培养基 只允许特定微生物生长，而同时抑制或阻止其他微生物生长的培养基,土壤,目的菌优势,非目的菌,选择培养基直接分离,单细胞,选择培养基平板（含牛奶或酪蛋白唯一C、N源）,37培养,目的菌落菌落周围有透明蛋白水解圈,1、利用选择培养基进行直接分离,例一：分离筛选蛋白酶产生细菌,含牛奶选择培养基目的菌生长平板,营养选择因子：牛奶或酪蛋白,只允许分解利用蛋白质的目的菌生长，淘汰非目的菌长出的目的菌并不一定是同种细菌，但皆产蛋白酶,例一：分离筛选蛋白酶产生细菌,例二：分离筛选产高温淀粉酶（65）细菌,单细胞,选择培养基平板（淀粉为唯一C源）,65培养,淀粉
6、水解透明圈,目的菌菌落,选择因子：营养选择因子淀粉 环境选择因子65高温,人为创造一些条件只让所需的微生物生长，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。,2、富集培养法,富集培养是分离微生物菌种最强有力的技术之一,营养选择因子和生理条件选择因子可无穷尽组合，可从自然界选择分离各类特异微生物,例：从土壤中分离能产生半乳糖苷酶的微生物,富集培养,选择培养基分离,目的菌验证,如果培养物中只含有两种微生物，而且是有意识的保持两者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。,五、二元培养物,病毒和宿主细胞纤毛虫、变形虫和粘细菌,微生物纯培养分离方法的比较,六
7、、无菌技术,在分离、转接及培养纯培养物时防止其被其他微生物污染的技术称为无菌技术。它是微生物研究进行的关键。,用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物在转接、培养微生物时防止其他微生物的污染,1、所用物品的灭菌技术,A、玻璃或金属器皿灭菌,高温干热灭菌：干燥箱160170干热空气2h灭菌湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅121湿热灭菌30min,B、培养基或溶液的灭菌,湿热灭菌：高压蒸汽灭菌锅121湿热灭菌30min,C、血清或生长因子溶液灭菌,过滤除菌：细菌滤器,滤膜孔径小于细菌细胞的大小,上节课知识回顾,二、无菌技术,单孢子分离,选择培养分离,二元培养物,一、微生物分离纯化方法,1、所用物品的灭
8、菌技术,玻璃或金属器皿灭菌,培养基或溶液灭菌,血清或生长因子灭菌,2、接种,接种:将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种.,无菌接种:培养基经高压灭菌后，用经过灭菌的工具在无菌条件下将含菌材料接种于培养基上，这个过程叫做无菌接种。,1.接种针 2.接种环 3.接种钩 4.接种锄 5.接种铲6.接种匙 7.接种刀 8.接种刀9.剪刀10.钢钩 11.镊子 12.弹簧接种枪13.接种、枪（日本式）,涂布棒,弹簧接种枪,接种环的灭菌,接种环烧红,接种环稍冷却,接种工具,挑选单个菌落,划线,1、实验台2、空气,环境条件,七、微生物的保藏技术,菌种保藏的原理：根据菌种特性及
9、保藏目的的不同，给微生物菌株以特定的条件，使其存活而得以延续。例如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养等条件，使菌株的代谢水平降低，乃至完全停止，达到半休眠或完全休眠的状态。,传代培养保藏冷冻保藏干燥保藏纸片保藏薄膜保藏寄主保藏,微生物菌株保藏的方法：,传代保藏,斜面、半固体琼脂柱、液体,传代培养保藏,斜面：可保存数周至数年，可用石蜡或橡皮塞封口，低 温延长保存时间 液体：菌苔制成菌悬液，低温（悬液保藏法）缺点：繁琐、易污染、变异丧生原有特性,冷冻保藏,液氮保藏、低温冰箱等 液氮可达196，效果较好,注意：速冻，减少冰晶损伤细胞,冷冻保藏法,细胞体积大的要比体积小的对低温更敏感；无细胞壁的比有细胞
10、壁的更敏感。,干燥保藏,沙土管保藏、冷冻真空干燥 保藏,沙土管：产孢子菌。制成孢子悬液，加无菌沙土管，减压抽干水分，石蜡封口，冰箱保存。冷冻真空干燥：加保护剂样品预先冷冻，真空冰升华去水，低温保存，保存数十年，目前最普遍、最重要的方法，菌种保藏中心多采用此法。菌种保藏时采用不同手段保藏，防止某种方法失败导致菌种丧失。,干燥保藏法,标准菌株的保存使用,1.长期保存的储存菌株以冷冻干燥保藏为主，特殊要求的菌种可用其它方法进行保存，保存期可长达几年至几十年。2.半储存菌株以含20%甘油的肉汤或液体石腊封存的半固体琼脂为主，在0以下保存，保存期为36个月。3.应用菌株以琼脂斜面为主，在4保存，保存期为
11、13个月。4.菌种的传代不可超过6次。视菌种的特性及使用情况，一般储存菌株每5年传记代一次，每1-2年从储存菌株转接至半储存菌株，半储存菌株每3-6个月传代一次，每1-3个月从半储存菌株转接接至应用菌株。5.每次检验用的菌株必须是从应用菌株转接的新鲜菌株。每支应用菌株用两次后必须销毁（121，0.1MPa高压灭菌处理15分钟以上）。,国内外菌种保藏部分情况,我国于1979年7月成立了中国微生物菌种保藏管理委员会(CCCCM).该委员会下设6个菌种保藏管理中心,其负责单位、代号及保藏菌种的性质如下:,普通微生物菌种保藏管理中心(CCGMC)-中科院微生物所,北京(AS),真菌、细菌;中科院武汉病
12、毒研究所,武汉(AS-IV),病毒。农业微生物菌种保藏管理中心(ACCC)-中国农业科学院土壤肥料研究所,北京(ISF)。工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)-轻工业部食品发酵工业科学研究所,南京(ID),真菌;卫生部药品生物制品检定所,北京(NICPBP),细菌；中国医学科学院病毒研究所,北京(IV),病毒。,抗菌素菌种保藏管理中心(CACC)-中国医学科学院抗菌素研究所北京(IA)；四川抗菌素工业研究所,成都(SIA),新抗菌素菌种;华北制药厂抗菌素研究所,石家庄(IANP),生产用抗菌素菌种。兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)-农业部兽医药品监察所,北京(CIVBP)。除了上述保藏
13、中心外,我国从事微生物研究并保藏有一定数量各类专业用微生物菌种的科研单位、大专院校还有近百所。,世界55个国家的菌种保藏机构共352个,目前主要的菌种保藏机构有:美国的“美国典型菌种收藏所”(ATCC)，保藏方式主要采用冷冻干燥和液氮超低温冻结法。美国“农业研究服务部菌种收藏所”(ARS)设立在“北方地区研究室”(NRRL);荷兰“真菌中心收藏所”(CBS);日本“大阪发酵研究所”(IFO);法国“里昂巴斯德研究所”(IPL);西德“柯赫研究所”(RKI);苏联“苏联科学院微生物研究所”(IM)。,作业,1、名词解释：无菌技术、单细胞分离 2、一般可用哪些方法获得微生物的纯培养物？,上节课知识回顾,微生物分离纯化方法,用固体培养基分离、纯培养,稀释倒平板法,涂布平板法,平板划线法,稀释摇管法,用液体培养基分离、纯培养,单孢子分离,选择培养分离,二元培养物,
