微生物的遗传变异与育种.ppt

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1、微生物的遗传变异与育种,第八章,本章内容：,基因突变与诱变育种基因重组菌种的衰退、复壮及保藏,第一节 基因突变与诱变育种,一、基因突变：,（一）突变类型：,基因突变与诱变育种,细胞形态形态突变型 菌落形态 营养缺陷型生化突变型 抗性突变 抗原性突变（包括细胞内部、表面成分的 改变）致死性突变型（合成关键性酶的基因发生了突变，则表现 出致死突变）条件致死突变型：如突变为温度敏感型（37死，25 活）其它突变型：毒力突变、糖发酵突变、产量、产品突变等,按表型分,温度敏感型突变,基因突变与诱变育种,（二）突变的特点：,1）不对应性：环境与变异无对应性 2）自发性：非人为的诱变因素下发生 3）稀有性：

2、生物体的自发突变率为10-1010-12 4）独立性：一个基因的突变对其它基因突变无 影响 5）诱变性：诱变剂可提高突变率10105倍 6）稳定性：突变性状稳定、可遗传 7）可逆性：有回复突变,基因突变与诱变育种,（三）基因突变自发性及不对应的证明：,基因突变与诱变育种,变量彷徨试验：涂布试验试验：平板影印培养试验：,自发突变：没有人工诱变因素的参与，生物体的自然突变,1.变量彷徨试验：,1)抗性细胞的出现，是在接触噬菌体之前；2)喷上噬菌体，仅起淘汰野生型和鉴别抗性株作用；3)由于甲方高度彷徨，说明突变是随机的。,基因突变与诱变育种,2.涂布试验,基因突变与诱变育种,1、突变与噬菌体无关；2

3、、涂布使抗性菌株均匀分布；3、抗性突变可在任何时间发生，与噬菌体存在无关。,以上实验用统计学原理间接证明。,3.平板影印,基因突变与诱变育种,实验表明：从未接触 str 的菌株可发生抗性突变，分离可得到纯的 str r 菌株。,由此表明：,突变是自发的与环境不对应的。,基因突变与诱变育种,（四）基因突变的机制：（自学）（五）紫外线(U.V)对DNA的损伤及修复:（自学）,二、突变与育种,（一）自发突变与生产育种,基因突变与诱变育种,1.生产选育：群体培养中个别的变异个体表现出 生长优势，发现突变种后，随时分离、纯化。2.定向培育：用特定的环境长期处理某一微生物 群体,同时不断对其移种、传代，以

4、达到积累 和选择合适的自发突变 体的一种育种方法.,3、自发突变的机制：,自发突变(spontaneous)：在非人为的情况下由于 遗传 物质的微小变化引起的性状变异。原因可能是：1）环境因素；2）自身有毒产物的积累；3）互变异构效应；4）环出效应等。,基因突变与诱变育种,（二）诱变育种,1.概念：诱变育种是用物理或化学的诱变剂使诱变对象内的遗传物质（DNA）的分子结构发生改变，引起性状变异并通过筛选获得符合要求的变异菌株的一种育种方法。,基因突变与诱变育种,2.诱变剂：,2）种类：物理因子（phisical agents)化学因子(chemical agents)转座子(transposab

5、le elements)物理诱变剂：U.V、快中子、超声波等。,基因突变与诱变育种,1）概念：凡能提高基因突变频率的理化因素。,化学诱变剂：,烷化剂(alkylating agents)：如：氮芥、硫酸二乙酯、亚硝基胍、NTG等 机制：将烷烃加在含氮碱基上，改变氢键性质 碱基类似物(base analogs)：如：叠氮胸腺嘧啶（AIT）等；机制：在DNA复制时将碱基类似物插入DNA中，而碱 基类似物没有正常碱基的氢键性质，在DNA复 制时出现突变体。,基因突变与诱变育种,插入剂(intercalating agents):,如：溴化乙啶等一些三环分子。机制：与DNA中的一对碱基有大致相同的位点

6、，这些分子 不改变碱基的氢键性质，而插入在双螺旋中，加宽间 距，引起碱基增加。,基因突变与诱变育种,3.诱变程序：,基因突变与诱变育种,原始菌种,纯化,斜面/肉汤培养,单孢子/单细胞悬液,诱变剂处理,平板分离,移至斜面,小试,中试,初筛,复筛,计算存活率,观察形态变异，挑单菌落,良种保藏,原菌种特性鉴定,4.诱变的主要环节,1）诱变剂的选择：,基因突变与诱变育种,a.了解诱变剂的性质、作用机理和使用方法b.处理方式：单一因子处理：复合因子处理：两种以上因素,先后使用同时使用单一因子重复使用,c.处理剂量：测致死率。,方法,平板菌落计数法纸片法,一般杀菌率为70%左右。,基因突变与诱变育种,Am

7、es test：对化学诱变剂做检测,菌种：鼠伤寒沙门氏菌 his-；原理：his-在基本培养基上不长；而发生回复突变则长。,基因突变与诱变育种,Ames test 方法示意图,用于检测食品、饮料、药物和饮水等样品的中致癌物,基因突变与诱变育种,2）出发菌株：育种的原始菌种；应具备：,对诱变剂的敏感性高；生产中选育过的自发变异菌株；本身具有一些有利性状；对代谢产物有一定积累；已经发生过某些变异。,基因突变与诱变育种,3）单孢子或单细胞悬液的制备,a.必要性：单细胞可以均匀地接触诱变剂 避免出现不纯的菌落菌种退化,基因突变与诱变育种,b.制备：物理诱变剂生理盐水（0.85%NaCl)化学诱变剂缓冲

8、液,c.方法：,三角瓶内加0.5cm玻璃珠打散10-15min;加.3%吐温80（表面活性剂）用无菌脱脂棉过滤。,d.浓度：细菌、放线菌 108个/ml 霉菌、酵母菌 106个/ml,基因突变与诱变育种,4)设计和采用效率高的筛选方案和方法,初筛：平板上做定性、半定量的测定，观察突变株 的生理效应范围。方法：梯度平板法；（抗性菌株）纸片法；（抗性菌株）透明圈法；（淀粉酶产生菌株等）变色圈法；（氨基酸生产菌株）,基因突变与诱变育种,如：用梯度平板法筛选抗性菌株,基因突变与诱变育种,抗生素法直接筛选抗药性突变体,基因突变与诱变育种,复筛：,较精确的生物化学分析方法 做摇瓶测定（见P250）,基因突

9、变与诱变育种,三、营养缺陷型的筛选,（一）概念：,基因突变与诱变育种,1.三种遗传型个体,营养缺陷型（auxotroph）：经诱变产生的一些合成能 力出现缺陷，而必须在培养基内加入相应 有机养分才能正常生长的变异菌株。如：lys-;bio-;,野生型(wild type)：自然界分离到的任何微生物，在 其发生营养缺陷突变前的原始菌株，为 该微生物的野生型。如：lys+;bio+;,原养型(prototroph)：指auxo突变菌株回复突变或重组 后产生的菌株，与野生型的表型相同。,2、筛选用的培养基,基本培养基（minimal medium,MM）-：满足野生 型菌株营养要求最低成分的组合。完

10、全培养基（complete medium,CM）+：满足一 切auxo生长的天然或半组合培养基。补充培养基（supplemented medium,SM）x：在 MM中有针对性地加入一或几种营养成 分以满足相应 auxo生长的组合培养基。,基因突变与诱变育种,（二）筛选方法,auxo的鉴定,基因突变与诱变育种,诱变处理,auxo的浓缩,auxo的检出,1.诱变处理（同前）,auxo的筛选程序：,基因突变与诱变育种,细菌培养,离心洗涤,诱变处理,CM后培养,洗涤,MM加PN,涂布于CM平板,影印培养,挑取,鉴定,菌种保存,2.auxo的浓缩：,基因突变与诱变育种,1）抗生素法：原理：青霉素、制霉

11、菌素等抗生素作用于生长着的微生物细胞，对休止态细胞无作用。方法：菌培养在含抗生素的MM基中。,2）菌丝过滤法：,适用于丝状（放线菌、霉菌）原理：基本培养基上只有发育成菌丝；auxo孢子可通过滤膜，野生型菌丝不能通过。,基因突变与诱变育种,3）差别杀菌法：,基本培养基上只有野生型生长，加热杀死野生型营养体，保留auxo芽孢。细菌80酵母60 适用于产芽孢、孢子菌。,基因突变与诱变育种,3.auxo的检出,1）逐个检出法,基因突变与诱变育种,2）影印平板培养法,3）限量补充法（在mm中加0.01%蛋白胨，auxo菌落小，野生型菌落大）,基因突变与诱变育种,3）夹层培养法,4.auxo的鉴定,基因突

12、变与诱变育种,1）生长谱法方法简便；回变和污染不影响 结果测定物质可为粉末 或纸片,混合氨基酸法步骤：,a.将多种营养因子编组，如：一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,基因突变与诱变育种,2）混合氨基酸（Vit）法,1）每组内无重复的营 养因子2）每组中应包含只出 现一次的因子3）每组中其他因子应 分别出现二次,营养因子分组编排时注意：,基因突变与诱变育种,b.将组合液的纸片放在涂菌的基本培养基上培养c.结果分析,a.将多种营养因子编组，如：一组：1 2 3 4 5 二组：2 6 7

13、 8 9 三组：3 7 10 11 12 四组：4 8 11 13 14 五组：5 9 12 14 15,5.auxo 的应用,1）作为标记菌株：进行基因工程、诱变育种、代谢过程的研究中的亲本标记；2）作为生产菌种：aa、核苷酸等生产菌种；3）作为aa、维生素、碱基的测定菌株。,基因突变与诱变育种,第二节 基因重组,本节内容：原核生物的基因重组 真核生物的基因重组,基因重组：,把两个不同性状个体内的遗传基因转移到一起，经遗传物质重新组合后，形成新遗传型个体的方式。,基因重组分子水平的杂交一般杂交细胞水平,基因重组,甲生长快、产量低,乙生长慢、产量高,基因重组,基因重组,如：,生长快、产量高,一

14、、原核生物的基因重组,（一）转化（transformation),基因重组,受体菌(receptor)直接吸收来自供体菌(donor)的DNA片段，通过交换，将其整合到自己的基因组中，再经复制就使自己变成一个转化子(transformation)。这种受体菌接受供体菌的DNA片段而获得部分新的遗传性状的现象，称转化或转化作用。,概念：,1.感受态,基因重组,不同菌株的亲缘关系 受体细胞是否处于感受态,感受态：受体细胞最易接受外源DNA片段并实 现其转化的一种生理状态。,不同菌出现感受态的时间不同。,转化的决定因素：,2.感受态因子,一种胞外蛋白质，分子量为510kD,基因重组,其作用为：,催化

15、转化，促进外来DNA片段吸收可降解细胞表面某种成分，使DNA受体暴露 1）不同菌细胞DNA受体位点不同2）有的菌感受态因子只对同种菌起作用,3.转化因子：,转化因子的本质是供体DNA片段一般为线状或闭合环状；单链或双链；转化的频率往往很低，一般为0.11%。据研究，呈质粒形式（双链闭合环状）的 转化因子，其转化频率最高,基因重组,4.转化的检出,甲（受体）strr，lys-,基因重组,如出现strr，lys+的菌株，则表明已经转化,乙（供体）strs，lys+,在含str的MM上培养,转化的全过程（以噬菌体为例）,基因重组,（二）转导(transduction),以噬菌体为媒介，把供体细胞的D

16、NA片段携带到受体细胞中，通过交换与整合，从而使后者获得前者部分遗传性状的现象，称为转导。获得新遗传性状的受体细胞，称转导子。,基因重组,概念：,转导以温和噬菌体为媒介，其从宿主DNA上诱导裂解时可能有三种情况：,1）包入的完全是噬菌体的DNA（噬菌体）2）包入的完全是细菌DNA（完全缺陷噬菌体）3）部分带有噬菌体基因的DNA（部分缺陷噬菌体）,基因重组,1.普遍转导（generalized transduction）,1）完全转导(complete transduction)：由完全缺陷噬菌体将外源DNA片段导入受体细胞，经交换、整合、复制形成遗传性状稳定的转导子。此时受体细胞的特点：a.不

17、发生溶源化；b.不显示免疫性；c.不会裂解产生正常噬菌体。2）流产转导(abortive transduction)：外源DNA片段不经交换、整合、复制，仅转录、转译和 性状表达。特点：子代只有一个细胞带有重组子性状。,基因重组,由完全缺陷噬菌体介导的转导现象。,2.局限转导：,指通过部分缺陷噬菌体把供体菌的少数特定基因携带到受体菌中，并获得表达的转导现象。,基因重组,部分缺陷噬菌体：噬菌体带有宿主gal基因dgal噬菌体噬菌体带有宿主bio基因dbio噬菌体特点：a、无正常溶源化能力；b、受体细胞不具免疫性。,根据转导频率的高低，可分为：,1）低频转导（LFT）：部分缺陷噬菌体比例低，获得局

18、限转导子量极少。,2）高频转导（HFT）：,双重溶源菌：感染dgal噬菌体后，又感染正 常噬菌体，且同时整合在菌染色体上。,HFT裂解物：诱导裂解双重溶源菌，裂解物 中含等量的两种噬菌体，称此裂解物为。,高频转导：用低感染复数的HFT裂解物感染 另一gal-受体菌时，可高频地将其转化 为gal+转导子，这种方式称,3.溶源转换与转导的区别（自学）,基因重组,（三）接合(conjugation),供体与受体细胞直接接触，借性菌毛传递大段DNA的过程。在受体细胞中发生交换、整合，使之获得供体菌的遗传性状的现象，称为接合。通过接合而获得新性状的受体细胞就称接合子。,基因重组,概念：,（四）原生质体融

19、合（protoplast fusion）,使遗传性状不同的两细胞的原生质体发生融合，并发生遗传重组以产生融合子（fusant）的过程。,基因重组,已成功地应用与植物细胞、真菌细胞、属间、科间的远缘细胞融合，融合产物含两亲代细胞基因组。,过程：,基因重组,二、真核微生物的基因重组,基因重组,（一）有性杂交,一般指性细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。,凡是能产生有性孢子的酵母菌或霉菌，原则上都能采用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。,（二）准性杂交（parasexual hybridization）,同种异株的两个体细胞融合，不经减数分裂而导致低

20、频基因重组发生的一种繁殖方式。（单倍体体细胞重组）,基因重组,1.准性生殖,2.准性生殖的意义：,对一些没有有性过程但有重要生产价值的半知菌来说，进行基因在染色体上定性研究、杂交育种，准性生殖提供了一个重要的手段。发现存在构巢曲菌、米曲菌、青霉等真菌和放线菌中，使之有普遍意义。,3.过程,1）菌丝联结（anastomosis）;2）形成异核体（heterocaryon）;细胞质、核交流形成异核菌丝体。3）核配（caryogamy)形成杂合二倍体;特点：频率低，10-510-7促成：樟脑熏蒸、紫外、高温4）体细胞交换和单倍体化,基因重组,半知菌的准性生殖示意图,基因重组,异核体的特点：,1）具有

21、感受性的两种菌丝间才可形成异核体；2）具有野生型性状，可在基本培养基上生长；（基因互补功能）3）大多数异核体的分生孢子不能在基本培养基 上生长；如能生长，则为异核体、或为杂合 二倍体（重组子）。,基因重组,异核体：同一菌丝有不同遗传性状的核在同一 细胞质中生长。同核体：同一菌丝中只有一种核。,体细胞交换和单倍体化,杂合体细胞中有极少数细胞核在进行有丝分裂的过程中，能发生体细胞染色体间的交换、分离（单倍体化）而产生具有新性状的单倍体杂合子、双倍体及非整倍体。,A,B,A+B,（同核体）,（异核体）,A,A,B,B,AB,A,A,B,B,（杂合二倍体）,单倍体杂合子,基因重组,4.检出：,1）若M

22、M和CM上差别不大的，为稳定 的杂合二倍体2）若MM上不长，CM上大量长，为不 稳定异核体,基因重组,第四节 菌种的衰退、复壮及保藏,一、菌种的衰退和复壮,1.衰退：概念：菌种经长期的人工培养或保藏，在 其自发突变的影响下，引起某些优良 性状变弱或消失的现象，称为衰退。,菌种的衰退、复壮及保藏,现象：,菌落和细胞形态的改变；生长速度缓慢，产孢子越来越少；代谢产物生产能力或其对宿主寄生 能力下降；抵抗力、抗不良环境能力减弱等。,衰退的原因：有关基因负突变,1）多次传代造成负突变数量增加 如斜面保藏：细菌：1个月 酵母菌：3个月 放线菌、霉菌、芽孢：半年2）培养条件；3）诱变时出现不纯菌落。,菌种

23、的衰退、复壮及保藏,2.防止衰退的方法：,控制传代次数；选择合适的培养条件；采用不同类型的细胞进行传代；采用有效的菌种保藏方法。,菌种的衰退、复壮及保藏,3.菌种的复壮：,复壮：使衰退的菌种恢复原来优 良性状的方法。,复壮的方法：,1）纯种分离：菌落纯（划线法、涂布法、倾注法）菌株纯（单细胞挑取法）2）通过寄主体进行复壮；3）淘汰已衰退的个体。,菌种的衰退、复壮及保藏,二、菌种保藏：,1.目的：,存活，不丢失，不污染防止优良性状丧失随时为生产、科研提供优良菌种,2.原理：,创造一定条件，尽可能降低微生物代谢活动强度，使之基本上处于休眠状态。,条件：1）挑选优良纯种的休眠体；2）创造适合长期休眠

24、的环境条件（干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养、添加保护剂等）,菌种的衰退、复壮及保藏,3.方法：,1）暂时保藏法斜面保藏,方法：斜面置4冰箱保藏，定时传代原理：低温下，微生物代谢强度明显下降优点：适用于各种微生物、简便易行、易 于观察；缺点：保藏时间短、传代频、易退化、易 污染、工作量大。,改良方法：橡皮塞取代棉塞、加矿油,菌种的衰退、复壮及保藏,2）长期保藏法,方法：砂土管法 真空冷冻干燥法 液氮法,原理：运用干燥、低温和隔绝空气等手段，降低 微生物菌种的新陈代谢速率，使菌种的生 命活动处于半永久性的休眠状态，以达到 长期保存的目的。,菌种的衰退、复壮及保藏,1）砂土管法：,干法：（适用于部

25、分真菌、放线菌）将斜面上 孢子刮下，接种于无菌砂土管中（砂 装试管2/5)，搅拌均匀。湿法：斜面中加35ml无菌水制成菌悬液，取菌 悬液10滴加入砂土管，以管内砂全部湿 润为宜。,将砂土管置于干燥器中真空干燥，低温或室温下保藏 适用于放线菌、芽孢菌和某些真菌保藏。保藏时间几至几十年。,菌种的衰退、复壮及保藏,2）真空冷冻干燥法,原理：加有保护剂的菌悬液在冻结状态下予以真空干燥，使微生物细胞处于半永久的休眠状态，以达到长 久保藏的目的。方法：用无菌脱脂牛奶作保护剂，加入3ml于斜面中制成 菌悬液，分装在安瓿中速冻真空干燥。真空度维持在0.10.3mmHg,悬液维持冻结状，水分不断升华，至菌体混合物呈疏松状，熔封。优点：适用于各种微生物；便于大量保藏；可避免污染，菌种存活时间长（几到几十年）缺点：手续繁琐。,菌种的衰退、复壮及保藏,3)液氮超低温保藏法：,方法：用10%甘油、二甲亚砜或蔗糖和吐温80 作保护剂，将菌种分散于其中，或将长 菌的琼脂块放入保护剂中，熔封后迅速 降温至-35。预冻后保存在液氮超低温 冰箱中（-196）。优点：适用于各种微生物的较理想的保藏方法缺点：需专门设备 使用时速融，30 40水浴摇动，融后 以无菌手续开启,菌种的衰退、复壮及保藏,