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1、总RNA的提取、定量与RT-PCR,南方医科大学生物化学与分子生物学实验教学示范中心Expertimental Teaching Center of Biochemistry and Molecular Biology,完整RNA的提取和纯化,是进行RNA 方面的研究工作如Nothern杂交、mRNA分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。掌握从细胞中提取总RNA的方法熟悉紫外吸收法检测RNA浓度与纯度的原理及测定方法掌握RT-PCR基因扩增的原理和过程,目 的,实验流程,提取原理操作步骤,逆转录原理操作步骤,提 取总RNA,定 量,合成cDNA第一链,原理体系引物选择
2、,PCR,电泳原理电泳步骤,电 泳,计算方法操作步骤,第一部分 细胞总RNA的提取及定量Extraction and Quantitation of Cell Total RNA,所有RNA的提取过程中都有五个关键点：样品细胞或组织的有效破碎；有效地使核蛋白复合体变性；对内源RNA酶的有效抑制；有效地将RNA从DNA和蛋白混合物中分离；对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。,关 键 点,原 理,10-5g RNA/细胞 RNA分离的方法：异硫氰酸胍氯化铯超速离心法；盐酸胍-有机溶剂法；氯化锂-尿素法；蛋白酶K-细胞质RNA提取法；异硫氰酸胍-酚-氯仿一步法(Trizol法)等。目前常
3、用的是Trizol法。,原 理,Trizol 是一种新型总 RNA 抽提试剂其主要成分是异硫氰酸胍和酚。异硫氰酸胍属于解偶剂，是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，其主要作用是裂解细胞，使细胞中的蛋白/核酸物质解聚得到释放。酚虽可有效的变性蛋白质，但是它不能完全抑制RNA酶活性，因此Trizol中还加入了8-羟基喹啉、-巯基乙醇等来抑制内源和外源RNase。,在加入氯仿离心后，氯仿比重大，使溶液分为水相、中间层和有机相。RNA在上层水相中，DNA和蛋白质位于中间层，有颜色的下层为有机相。取出水相用异丙醇沉淀可回收RNA；用乙醇沉淀中间层可回收DNA。,原 理,RNA酶污染来源,RNA酶可耐受
4、多种处理而不被灭活，如煮沸、高压灭菌等。严格控制外源性RNA酶的污染：外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等，也可存在于灰尘中，造成器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂的污染。最大限度地抑制内源性的RNA酶：而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。,常用的RNA酶抑制剂,焦碳酸二乙酯（DEPC)是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。异硫氰酸胍 目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白体中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
5、RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin)从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。其他 SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。,防止RNA酶污染的措施,所有的玻璃器皿均应在使用前于180的高温下干烤6h或更长时间。塑料器皿可用0.1%DEPC水浸泡12h以上，高压灭菌。有机玻璃的电泳槽等，可先用去污剂洗涤，双蒸水冲洗，乙醇干燥，再浸泡在3%H2O2室温10min，然后用0.1%DEPC水冲洗，晾干。配制的溶液应尽可能用0.1%DEPC在37处理12h以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应
6、当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制，然后经滤膜过滤除菌。操作人员戴一次性口罩、帽子、手套，实验过程中手套要勤换。设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。,操作步骤,样品处理提取组织RNA时，每50100mg组织用1ml Trizol试剂对组织进行裂解；悬浮细胞先离心沉淀，每5-10 106个细胞加1ml Trizol后，反复用枪吹打或剧烈振荡以裂解细胞。培养贴壁细胞不须消化，可直接用Trizol进行消化、裂解，Trizol体积按10cm2/ml比例加入。(注意：匀浆一定要彻底，是提取高质量RNA的前提；细胞数量与Trizol的比例，细胞的数量不能过多。)实验材料：人胚胎肾细胞293,操作
7、步骤,细胞或组织加Trizol（RNAisoPlus）后剧烈振荡15s，室温放置5min，使其充分裂解。（注意：此时可放入-70长期保持）按0.2ml 氯仿/1ml Trizol加入氯仿(本实验加100l)，剧烈振荡混匀后室温放置5min。(注意：此步振荡非常重要，建议在旋涡振荡器上进行。)4 12,000g离心15min。样品分为三层：底层为黄色（红或绿）有机相，上层为无色水相和一个中间层。RNA主要在水相中，水相体积约为所用Trizol试剂的60。吸取上层水相，至另一离心管中。一般400-450l 就足够了，宁少勿多！（注：千万不要吸取中间界面）,操作步骤,加入等体积异丙醇混匀，4放置5-
8、10min。4 12,000g离心10min，弃上清，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。按1ml 75%乙醇/ml Trizol加入75%乙醇洗涤RNA沉淀，（切勿触及沉淀！）温和振荡离心管，悬浮沉淀。4 12,000g离心5min，尽量弃上清。室温晾干或真空干燥RNA沉淀5-10min。（注：RNA样品不要过于干燥，否则很难溶解。）加入10l无RNase的水，充分震荡混匀。,操作步骤,收集适量细胞，加500l Trizol,用移液枪反复吹吸，直至裂解液中无明显沉淀,向裂解液中加100 l氯仿,4,12000g 离心15min,吸取上清液200250 l 至另一新离心管中(切忌吸出白色中间层),
9、向上清中加入等体积异丙醇混匀,4,12000g 离心10min,缓慢沿离心管壁加入500l 75%乙醇,4,12000g 离心5min小心尽量弃去乙醇,加入10l RNase-free水溶解沉淀备用,室温静置5min,盖紧离心管盖，用手振荡15s,室温静置5min,上下颠倒离心管充分混匀,室温静置10min,小心弃去上清,室温干燥沉淀2-5min,（1）,（2）,（3）,（4）,（5）,（6）,（7）,（8）,（9）,洗涤离心管壁,轻轻上下颠倒,原 理：物质在光的照射下会产生对光的吸收效应 而且物质对光的吸收是具有选择性的各种不同的物质都具有其各自的吸收光谱,因此不同波长的单色光通过溶液时其光
10、的能量就会被不同程度的吸收，光能量被吸收的程度和物质的浓度有一定的比例关系.,紫外光吸收法,紫外吸收检测RNA的浓度,RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约 40g/ml 的单链RNA。用双蒸水稀释RNA样品（1lRNA+49l水）倍并以双蒸水为空白对照，根据此时读出的OD260 值即可计算出样品稀释前的浓度:RNA(mg/ml)=40OD260 读数稀释倍数(n)/1000,RNA纯品:OD260/OD280 2.0(1.82.0)，OD260/OD230 2.0 若OD260/OD280小于1.8，说明样品中还可能含有蛋白
11、质或酚，应再用酚/氯仿抽提，以乙醇沉淀纯化RNA。若OD260/OD280大于2.0，则提示可能有异硫氰酸残存或RNA降解。OD260/OD230比值小于2.0时表明有小分子及盐存在。,紫外吸收检测RNA的纯度,RNA完整性检测,完整的RNA的甲醛电泳可明显地观察到28S和18S两条带，并且28S大约是18S的两倍宽。若两条带不明显,则说明RNA部分降解,可能的原因是污染了RNase。,常见问题分析,RNA得率低：A.样品裂解或匀浆处理不彻底。B.RNA沉淀未完全溶解。A260/A2801.65：A.RNA应使用TE Buffer稀释后再进行吸光度值的测定。低离子浓度和低pH值条件下A280值
12、偏高。B.样品匀浆时加的试剂量太少。C.匀浆样品时未在室温放置5分钟。D.吸取水相时混入了有机相。E.RNA沉淀未完全溶解。,RNA降解 A.组织取出后没有马上处理或冷冻。B.待提取RNA的样品没有保存于-60至-70，而保存在了-5至-20。C.细胞在用胰酶处理时过度。D.溶液或离心管未经RNase去除处理。E.电泳时使用的甲醛pH值低于了3.5。DNA污染 A.样品匀浆时加的试剂量太少 B.样品中含有有机溶剂(如乙醇，DMSO等)，强缓冲液或碱性溶液,常见问题分析,第二部分 逆转录-聚合酶链反应Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,
13、提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。,原 理,鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。在长时间的逆转录过程中，不会造成模板的降解，获得cDNA的几率大，适用于较长的cDNA链的合成。禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：有
14、强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。MMLV反转录酶的RNase H-突变体：商品名为Superscript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA，这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。,（一）反转录酶的选择,随机六聚体引物：用此种方法时，体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板，通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRN
15、A。Oligo(dT)：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞mRNA具有3端Poly(A+)尾，此引物与其配对，仅mRNA可被转录。由于Poly(A+)RNA仅占总RNA的1-4%，故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。特异性引物：是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物，用此类引物仅产生所需要的cDNA，导致更为特异的PCR扩增。,（二）引物的选择,（三）内参的设定,为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参照基因的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。常用的内参有GAPDH（3-磷酸甘油醛脱氢酶）、
16、-Actin（-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一、各孔间的温度差等所造成的误差。,仪器和主要试剂,基因扩增仪、微量加样枪、灭菌超薄PCR反应管总RNA第一链cDNA合成试剂盒（含有逆转录酶、RNA酶抑制剂、缓冲液）dNTP mix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2 mmol/L,操作步骤,采用TaKaRa PrimeScript RT reagent kit进行cDNA第一链合成：按下列组分配制RT反应液5X PrimeScrip Buffer 2 l PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 l Oligo
17、 dT Primer(50 M)0.5 l Random 6mers(100 M)0.5 l RNase free H2O 1.5ulTotal RNA 5 l 反转录反应条件如下37 15min（反转录反应）85 5sec（反转录酶失活反应）注：反转录步骤在PCR仪中进行,操作步骤,采用TaKaRa PrimeScript RT reagent kit进行cDNA第一链合成：按下列组分配制RT反应液5X PrimeScrip Buffer 2.0l PrimeScript RT Enzyme Mix 0.5 l Oligo dT Primer(50 M)0.5 l Random 6mers(
18、100 M)0.5 l Total RNA 6.5 l 总体积 10l反转录反应条件如下37 15min（反转录反应）85 5sec（反转录酶失活反应）注：反转录步骤在PCR仪中进行,取0.2 ml PCR反应管一只，用微量加样枪按下述顺序分别加入各试剂(注意每换一种试剂换一个新吸头)：,如配好的反应液较多沾到管壁上，可将PCR反应管置台式离心机中瞬时离心，使反应液集中于管底，然后将反应管放到基因扩增仪(PCR仪)上.,PCR反应体系,94预变性5分钟后开始以下循环 94 30 秒 55 30 秒 30 循环 72 30 秒 72 5 分钟 4 保温实验过程约1小时30分钟,PCR参数设置,P
19、CR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94变性30s，60退火30s，72 延伸45s。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。,PCR反应的温度循环周期,本实验所扩增的产物DNA片段长度400bp500bp,可取5l PCR产物以1%琼脂糖凝胶电泳进行检测。利用标准DNA marker评估扩增的特异性。,琼脂糖凝胶电泳,琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动.DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与
20、分子筛效应。不同的DNA，分子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带(迁移速度与分子量的对数值成反比关系).,琼脂糖凝胶电泳原理,影响迁移速率因素,1、DNA的分子大小 2、琼脂糖浓度 3、DNA分子的构象 4、电源电压 5、嵌入染料的存在 6、离子强度影响,琼脂糖凝胶电泳原理,有效分离范围,实验材料,电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚蓝呈蓝紫色；二甲苯晴呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。染料：Gelview、EB电泳缓冲液：TBE琼脂糖DNA Marker 5000,溴化乙锭(EB):3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，可与
21、DNA结合,在紫外光照射下呈现红橙荧光,有致癌性.Gelview:是一种新型核酸染料,可与DNA分子形成复合物，能产生极强的荧光信号，其灵敏度比EB高,且荧光强度与DNA含量成正比荧光,在紫外光照射下呈现绿色荧光.,常用染料,实验材料,含有分子量不同的DNA片段，主要用途就是DNA分子凝胶电泳时，加样用做对比来检测目的基因片段大小。应选择在目标片段大小附近ladder较密的marker，这样对目标片段大小的估计较准确。,DNA Marker,实验材料,凝胶准备,胶床准备,铺胶,静置,胶床置于电泳槽中,加电泳缓冲液,拔梳子,上样,电泳,取出凝胶,拍照,实验步骤,倒胶时把握好胶的温度，不要高于60，否则温度太高会使制板变形胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏点样孔电泳前，确认样品孔位于电场负极；点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡，缓冲液不要太多Gelview有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔紫外线照射不要太久,注意事项,
