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1、质粒DNA的酶切鉴定,限制性内切酶是DNA操作过程中所使用的基本工具。其特异性地结合于一段特殊DNA序列之内或其附近的特异位点上，并在此切割双链DNA。分子克隆中常用的为II类限制酶，其识别位点长度为4、5或6个核苷酸的反向重复序列。限制酶的切割点因酶而异，有些产生带平端的DNA片段，而另一些产生带有粘性末端的DNA。,实验原理,限制性内切酶切割DNA,Construction of pGEX-740,A:,B:,Strategy of construction,C:Identify positive clone,The product of PCR,在一个洁净的1.5 ml离心管中混匀下列反
2、应物：,实验方案,注意采用混合配样,酶切一小时后，每管加入5 ul的6xloading buffer，中止反应，混匀。2025 ul上样，在一个泳道中加入10 ul DNA Marker。,根据核酸的解离性质，用中性或偏碱性的缓冲液使核酸解离成阴离子，置于电场中便向阳极移动，这就是电泳。凝胶电泳有许多优点：简单、快速、灵敏、成本低。常用的凝胶电泳有琼脂糖(agarose)凝胶电泳和聚丙烯酰胺(poly-acrylamide)凝胶电泳。可以在水平或垂直的电泳槽中进行。凝胶电泳兼有分子筛和电泳双重效果，所以分离效率很高。,核酸电泳,(一)琼脂糖凝胶电泳 以琼脂糖为支持物。电泳的迁移率决定于以下因素
3、：1.核酸分子大小 迁移率与分子量对数成反比。2.胶浓度:迁移率与胶浓度成反比。3.DNA 的构象:一般条件下迁移率:超螺旋DNA 线形DNA开环DNA 4.电压:一般不大于5V/cm。在适当的电压差时，迁移率 与电流大小成正比。5.碱基组成:有一定影响，但影响不大。6.温度：430都可，常在室温。电泳时，在胶中加人荧光染料如溴化乙锭(EB)，EB 为扁平分子，很易插入DNA中的碱基对之间。DNA与 EB结合后，紫外光照射时可发射出红橙色可见荧光。Eb可引起移码突变。,DNA鉴定的三种荧光染料及与DNA的相互作用,（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳 以聚丙烯酰胺作支持物。常用垂直板电泳。单体丙 烯酰胺在
4、加入交联剂后，就成聚丙烯酰胺。由于这 种凝胶的孔径比琼脂糖凝胶的要小，所以可用于分 析分子量小于1000 bp的DNA片段。聚丙烯酰胺中一 般不含有RNase，所以可用于RNA的分析。但仍要留 心缓冲液及其他器皿中所带的RNase。聚丙烯酰胺凝胶上的核酸样品，经啡啶溴红染色，在紫外光照射下，发出的荧光很弱，所以浓度很低 的核酸样品不能用此法检测出,注意事项直接在抽提的质粒DNA管中加入酶切体系。为使微量操作更精确，可以4个人（8 tubes）一起做9 份酶切 体系混合液，然后再分装10ul于各质粒管中。上样时要小心操作，防止样品溢出。接触凝胶时，因其中含有EB或荧光染料，要戴手套，废物丢弃要在固定位置。不接触凝胶时不需戴手套！5.EB是极强致癌物！小心！,思考题1、影响限制性酶切的因素有哪些？2、结合实验情况，如何提高限制性酶切的反应效率？3、如何设置酶切反应的对照？,
