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1、无菌操作技术原理及实验,无菌操作技术,定义：指在实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。,目的：保证培养物不被环境中微生物污染；防止被检微生物在操作中污染环境或感染操作人员。,范围：微生物无菌操作技术；细胞无菌培养。,微生物无菌操作技术及接种技术,原理：无菌技术：指在微生物实验工作中，控制或防止各类微生物的污染及其干扰的一系列操作方法和有关措施。接种：将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程。,1接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀,无菌操作材料：接种工具,无菌器材准备：,灭菌器材：枪头、玻
2、璃器皿、培养基、无菌衣等进行高压灭菌处理。,培养基的制备：,目的菌：大肠杆菌LB培养基：（蛋白胨易吸湿，应迅速称取；称取一种药品后，药匙洗净擦干后再称另一种药品。）；（勿调过头，以免回调而影响各离子浓度。）分装要求：（分装时，不要使培养基沾在瓶口，以免玷污瓶塞而引起污染。）液体：试管：试管高度的1/4；三角瓶：不超过容积的1/2；固体：试管：不超过1/5，灭菌后制成斜面；平皿：15ml。灭菌条件：121，20min。（温度时间不宜过高过长，以免破坏营养物质）抗生素的加入：放至50，握紧3s不烫手。无菌检查：将灭菌培养基放入37的培养24-48h后观察。,灭菌方式：,辐射灭菌：60Co-射线，医
3、疗器械、容器、生产辅助用品、不受辐射破坏的原料药及成品等。干热灭菌法：利用干热空气达到杀灭微生物或消除热原物质的方法。160170*120min 以上、170180*60min 以上或250*45min。适用于耐高温但不宜用湿热灭菌法灭菌的物品灭菌，如玻璃器具、金属材质容器、纤维制品、固体试药、液状石蜡等均可采用本法灭菌。湿热灭菌法：热力灭菌中最有效、应用最广泛。121、30min。药品、容器、培养基、无菌 衣、胶塞以及其他遇高温和潮湿不发生变化或损坏的物品，均可采用本法灭菌。气体灭菌法：环氧乙烷、气态过氧化氢、甲醛、臭氧（O3）等。过滤除菌法：除菌滤膜分亲水和疏水，孔径一般不超过0.22um
4、。过滤器不得对被滤过成分有吸附作用，也不能 释放物质，不得有纤维脱落。紫外线灭菌：UVC200-300nm，254-257nm灭菌能力最强。原理：诱导胸腺嘧啶二聚体的形成和DNA链的交联，从而抑制了DNA的复制；产生臭氧共同杀菌。,高压灭菌锅操作步骤及注意事项：,仪器检查：仪器摆放在水平地面上，周围有空隙。加水：水位至平台处，不要过多。使用去离子水。摆放：相互间有适当缝隙，有利于蒸汽的穿透，提高灭菌效果。密封：顺时针旋转，直到不到旋转为止。加热：打开开关，检查温度和时间。排气：打开放气阀价格你干冷空气排出。灭菌：干冷空气排出 后，拧紧阀门。结束：关闭开关，压力降至0打开放气阀排尽余气后方可打开
5、高压锅。,注意：高压带有液体的瓶子时要旋松瓶盖，防止瓶内压力过大使瓶子碎裂；包有报纸的物品，立即进行干燥处理。,抗生素的配制及保存：,选用合适溶剂溶解后，0.22um过滤除菌。氨苄青霉素：-20长期保存，4保存一个月，37保存2-3天。卡那霉素、四环素、链霉素：-20长期保存，4、37比氨苄保存时间稍长，四环素避光保存。,无菌环境的要求与保持：,无菌环境,无菌室超净工作台（原理：在特定的空间内，洁净空气（过滤空气）按 设定的方向流动而形成的。）,使用前打开紫外灯照射4060分钟开启超净工作台工作电源，关闭紫外灯，并用75%的酒精或0.5%过氧乙酸喷洒擦拭消毒工作台面。使用中，有机玻璃罩受到污染
6、，严禁用酒精棉球擦拭，请用含水棉布檫拭；请保持超净台整洁、干燥，不要堆积杂物；使用完毕，关闭煤气开关或酒精灯；使用完毕后，用消毒液擦拭工作台面，关闭工作电源，重新开启紫外灯照射15分钟.定期将初效过滤器拆下清洗，清洗周期一般为3-6个月；高效空气过滤器的使用期限为十八个月。定期做无菌试验，以测定净化台是否符合无菌要求。,超净台的使用与维护,无菌操作要求：,（1）在操作中不应有大幅度或快速的动作；（2）使用玻璃器皿应轻取轻放。（3）在火焰上方操作，水平距离5cm范围内为无菌区域。（4）接种用具在使用前、后都必须灼烧灭菌；（5）在接种培养物时，动作应轻、准。（6）不能用嘴直接吸吹吸管。（7）带有菌
7、液的吸管、玻片等器材应及时置于盛有5%来苏尔溶液的消毒桶内消毒。（8）酒精灯使用时，酒精量不超其容积的2/3，也不能少于1/3。,接种技术：,常用接种方法：斜面接种划线接种液体接种穿刺接种,接种的基本程序：,斜面接种：从已生长好的菌种斜面上挑取少量菌种移植至另一新鲜斜面培养基上的接种方法。用于需氧性微生物的接种。,标记：接种前在试管上注明菌名、接种日期、接种人姓名点燃酒精灯。接种步骤：,由斜面菌接种到液体培养基（如试管或三角瓶等）中的方法。意义：质粒的扩增，蛋白的大量表达。操作方法：与斜面法基本一致，只是在将接种环送入液体培养基时使环在液体与 管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，塞上棉塞再轻轻
8、摇匀。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种,液体接种,划线接种与平板涂布,使混合的细菌呈单个分散生长，形成单个菌落，以便获得纯菌、活菌计数。方法：分区划线法：适用于含菌量较多的标本 连续划线法：适用于含菌量较少的标本,分区划线法,连续划线法,注意：平板倒置放置（防止皿盖水珠滴在菌落上；重力作用下营养下沉为菌体提供营养）。平皿底部标注姓名、日期及样品名，防止平皿较多时错盖皿盖弄乱样品。,用接种针从菌种斜面上挑取少量菌体并把它穿刺到固体或半固体的深层培养基中的接种方法。用于厌气性细菌培养、检查细菌的运动能力、保藏菌种。只适宜于细菌和酵母的接种培养,穿刺接种,接种步骤：（1）手持试
9、管（2）旋松棉塞（3）接种针灼烧灭菌，把在穿刺中可能伸入试管的其他部位也灼烧灭菌（4）拔出棉塞（5）取菌：用冷却接种针的针尖沾取少量菌种（6）穿刺：将接种针自培养基中心平稳、快速垂直刺入培养基，至接近试管 底部，然后沿接种线拔出（7）塞上棉塞（8）接种针灼烧灭菌,细胞培养,细胞室无菌环境的保持与维护：进入细胞室前，在缓冲间换实验服、换拖鞋；每天早上打扫细胞并紫外照射半小时。培养箱的使用与维护：定期灭菌；按位置摆放细胞瓶，方便查找，以免长时间敞开培养箱；不准对着打开的培养箱说话，以免培养箱的污染；细胞从培养箱取出时，拧紧瓶盖。细胞放进培养箱时，70%酒精擦拭瓶口；超净台内处理细胞时，防止操作人的手及任何物品从细胞瓶口上方经过，严格在酒精灯附近进行操作。,1.无菌操作的定义及目的是什么？2.在配制培养基过程中应注意哪些问题，为什么？3.如何检查灭菌后的培养基是否为无菌的？4.简述超净台使用与维护的注意事项5.无菌操作为什么使用酒精灯，酒精灯安全操作范围是多少？6.接种的基本程序是什么？常用的接种方法有哪些？7.平板划线接种有哪些？平板应标记哪些内容？标记注意事项是什么？8.平板培养应注意什么？原因是什么？,一：简答题,二：实验操作,
