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1、无菌环境和操作要求,制程三科：何学才2010年10月18日,董事长的经营理念,品质决定生存,品牌决定价值,通路决定成败,人力决定发展,企图决定版图,什么是品质？,安全,符合顾客要求，达到顾客满意！,安心,风味,清洁,没有危险物（生物、物理、化学）,清洁的进行生产（包括外包装）,任何时候都是同样喜爱的味道,品牌的力量,目 录,1、无菌线灌装流程,2、无菌系统的建立与维持,4、无菌线生产品质效果评估,5、附件,3、无菌线工艺关键控制点分析,hygienisches Umfeld良好卫生的生产环境,Sterile Abfll-&Verschlie-maschine无菌灌装与封盖设备(ACF-Anla
2、ge)(冷无菌灌装设备),Kappen盖,Luft 空气,Flaschen 瓶,Flaschen-desinfektion瓶杀菌,Getrnk饮料,KZE o.Filtration瞬时杀菌或过滤,HEPA-Fer高效空气过滤器,Kappen-desinfektion盖杀菌,1、无 菌 线 灌 装 流 程,2、无 菌 系 统 的 建 立 与 维 持,无菌的产品液,无菌的空瓶,无菌的瓶盖,无菌的环境,无菌的介质,无 菌 的 产 品 液,UHT灭菌,无菌罐缓存,无菌充填,无菌管路运输,1、CIP清洗做好设备清洗，保证管路内是洁净（即：药剂浓度、时间、温度及清洗后设备水质状况等）。2、SIP做好设备的
3、有效灭菌，保证设备的无菌（即：药剂浓度或过热水温度、时间等）。3、蒸汽障做好阀门的有效保护，保证阀切换时产品是无菌的（即：蒸汽温度、管路压差等）。,无菌的空瓶,无菌的瓶盖,一定浓度的PAA药剂进行空瓶灭菌，同时利用无菌水对杀菌后药剂的清洗。即：1、药剂浓度、温度、压 力、杀菌接触时间 2、无菌水压力、接触时 间、药剂冲洗后残留 状况,一定浓度的PAA药剂进行瓶盖灭菌，同时利用无菌水和空气对杀菌后药剂的清洗及冲洗水吹干。即：1、药剂浓度、温度、压力、杀菌接触时间 2、无菌水压力、接触时间、药剂冲洗后残留状况 3、无菌空气压力,无 菌 的 环 境,SOP,COP,正压罩风机过滤器压差,液封系统或机
4、械密封,气囊或焊接,1、COP清洗做好设备表面清洗，保证设备表面的洁净（即：药剂浓度、接触时间、区域等）。2、SOP做好设备的有效空间菌，保证设备的空间无菌（即：药剂浓度、时间、区域等）。3、机械密封及过滤器气体过滤压差，保证设备内无菌环境不会被 外界环境给污染（即：蒸汽障温度、区域压差、气囊压力等）。,无 菌 的 介 质,无菌水,药 剂,无菌空气,无菌氮气,洁净蒸汽,1、CIP清洗做好设备清洗，保证管路内是洁净（即：药剂浓度、时间、温度及清洗后设备水质状况等）。2、SIP做好设备的有效灭菌，保证设备的无菌（即：药剂浓度或过热水温度、时间等）。3、蒸汽障做好阀门的有效保护，保证阀切换时产品是无
5、菌的（即：蒸汽温度、管路压差等）。,交流时间！,CCP1 无菌水系统,CCP2 无菌空气/氮气系统,CCP3 空瓶瓶杀菌系统,CCP4 空瓶冲洗系统,CCP5 盖杀菌系统,CCP6 盖冲洗、吹干系统,CCP7 UHT系统,CCP8无菌罐系统,CCP9 充填系统,CCP10 封盖系统,CCP11 正压罩系统,3、无菌线工艺关键控制点分析,CCP1 无菌水系统,CCP2 无菌空气/氮气系统,CCP3 空瓶瓶杀菌系统,CCP4 空瓶冲洗系统,CCP5 盖杀菌系统,CCP6 盖冲洗、吹干系统,CCP7 UHT系统,CCP8无菌罐系统,CCP9 充填系统,CCP10 封盖系统,CCP11 正压罩系统,C
6、P1 吹瓶,CP2 喷码,CP3 套标、包装、码箱,放松一下！喝杯水润润口！后面更精彩！,1、生产中无菌水、无菌产品液、无菌空气、无菌 包材及成品的理化、微生物分析（略）。,2、生产过程前、中、后设备涂抹和空间落菌的微 生物分析（简单介绍目的）。,3、大修后或设备大异常后，进行的无菌验证确认（重点介绍无菌验证）。,4、无菌线生产品质效果评估,4-1无菌线涂抹的目的,1、监控生产线微生物状况,2、验证生产线COP消毒效果,3、根据检测结果指导改善消毒作业,4、给产品微生物不良品的原因分析提供依据,4-2无菌线无菌验证目的,a、为确认新安装无菌线的杀菌能力，系统无菌性的维持能力，以便量产后对产品的
7、微生物风险作更好的评估b、现有无菌线年度保养后的设备状况进行验证，为再生产提供保证c、对新瓶型、盖型在无菌线上的适用性进行验证，确保系统对新瓶型、盖型的杀菌性,无菌线无菌验证内容,S0 前提条件对设备一些关键参数及报警联动装置进行确认，为后续验证做好准备 S1 辅助系统测试对系统的介质状况进行初步判定，从而验证系统在正常的CIP/SIP后能否制备出无菌的介质，为后续验证做好准备S2 烟雾测试验证正压罩各区域压力状况，以及空间空气流动状况 S3 环境预测试验证系统经过正常的COP/CIP/SOP/SIP后正压罩空间是否能达到无菌状态,S4 染色试验本测试为评估COP效能所用，验证系统对正压罩内设
8、备表面的清洗效果，从而确认COP是否存在清洗死角，从而及时调整喷嘴位置，也为贴片试验做好准备 S5 贴片试验本测试为评估SOP效能所用,验证系统对正压罩内设备表面的杀菌效果，从而确认正压罩无菌环境的建立状况以及是否存在死角S6 瓶内、外挑战测试本测试是为验证瓶杀菌系统对瓶内杀菌的能力,S7 盖内、外挑战测试本测试是为验证盖杀菌系统对瓶盖内的杀菌能力 S8 灌水试验验证系统连续生产的能力，并验证UHT、无菌罐、充填系统的无菌状况，为后续培养基验证做好准备S9 培养基测试 一a、验证设备年度保养后的无菌状况，是否具备生产中性产品的能力 b、验证新瓶型、新盖型上机的适应性，是否具备可生产条件c、新线
9、UHT、无菌罐、充填系统的预测试,S10 培养基测试 二判定新安装无菌线是否具备可持续生产的能力 S11 培养基测试 三a、验证系统运行中无菌环境被破坏后，经过SOP后系统是否能继续维持生产状态 b、验证无菌罐无菌性最大维持时间S12 成品测试证明无菌生产线是具备商业生产的能力,无菌线各阶段测试方案,Thanks for Your Kind Attention,The End,附件为无菌验证各试验方法详解，大家有兴趣可以了解一下！,a.产品UHT及无菌水UHT、无菌罐和一体机的SIP/生产 程序验证，包括实际温度（温度试纸）、时间的检测，以及最低温度的预警程序，到达下限系统是否能够自 动报警并
10、停机b.瓶杀菌机喷嘴喷射压力、洗瓶机无菌水喷射压力自动检测效果及压力预警程序c.各蒸汽障的温度预警程序，低于最低值系统是否失去无菌d.杀菌剂的浓度、温度、流量预警程序，低于下限系统是否自动停机,S0 前提条件,S1辅助系统测试（无菌水、无菌空气及氮气的微生物状况）,系统在正常的CIP/SIP后对无菌水、无菌空气/氮气的总取样口以及各使用点终端取样口取样进行微生物分析，各点无菌水取样量至少1L，各点无菌空气/氮气取样时间至少30min,S2烟雾测试,系统分别在生产、待机、清洗三种模式下 用烟雾发生器在压力最高区域（充填区）发散烟雾，正压罩各区压力控制按照供应商提供说明书上压力设定值的下限,S3正
11、压罩环境预测试,经过正常的COP/CIP/SOP/SIP后，对空间进行落菌、浮游菌采集、涂抹、尘埃粒子的检测落菌：每个区域2个点，时间30min；浮游菌：每个区域1个点，时间30min；涂抹：每个区域5个点，每个棉签涂抹面积1dm2如涂抹充填头、洗瓶头或杀菌喷嘴每个棉签5个喷嘴或充填/洗瓶头；尘埃粒子：每个区域1个点且要对每个风机进行检漏,S4染色试验,1、称取0.54g罗丹明用100ml异丙醇溶解2、称取1.8g果胶+100g白砂糖+300ml80的热水充分溶解3、称取24g橙浓缩汁+100ml水中充分溶解4、将上述3种液体混合用喷壶喷洒在正压罩内任意区域5、喷洒后静止30min左右（具体时
12、间看溶液是否已粘附在设备表面）6、启动COP程序,S5贴片试验,1、准备钢片100片，钢片粗糙度的选择尽量接近设备表面的粗糙度2、用枯草芽孢杆菌接种钢片：105和106各50片(接种量10l-100l)3、钢片正常风干后，准备进行测试，先进行低浓度后进行高浓度试验4、基于无菌室/洁净室的尺寸,在其无菌区域确定至少30个对于系统灭菌重要的位置,即那些可能导致瓶盖、铝片、瓶子和产品污染的位置（可参考染色试验的结果）,和在清洁和杀菌时绝对有必要灭菌的位置,例如:冲洗阀、灌注阀、下盖槽和机星轮等装置的表面.,5、在一张灌装无菌区的图纸上将上述位置标出并标号.并将钢片编号和图纸一一对应，然后进行钢片的悬
13、挂6、在悬挂钢片前在50片钢片中随机抽取5片钢片进行阳性对照，其方法为：将钢片取回后分别放入5个已灭菌好的装有100ml无菌水的盒子里进行充分振荡，并进行梯度稀释，至少稀释5个梯度，分别进行膜过滤，培养后计数从而得到钢片的初始带菌量7、钢片悬挂后，根据供应商所提供说明书用清洗灭菌条件的下限对无菌线设备进行一次COP和SOP8、把所有钢片依次放入已编号已灭菌且装有无菌水的盒子里，到实验室充分振荡后进行膜过滤，培养后记录每片钢片残留的菌量9、106的实验同105一样,验证判定：用阳性对照检测的含菌量和杀菌后钢片残留的菌量进行对照，从而判定系统的杀菌能力，衰减计数法LOG(RAVE)=LOG(Rc/
14、Nsample)LOG(Sc/Ntest)Rc:阳性对照样带菌总数Nsample:阳性对照样数量Sc:测试样残留带菌总数Ntest:测试样数量LOG(RMIN)LOG(Rc/Nsample)LOG(Sc)Sc:测试样的残留带菌数最大样品的菌落数,S6瓶内、外挑战测试,瓶内挑战测试：1、准备在该线生产的空瓶480只以上（具体数量至少为瓶杀菌喷嘴数的4倍）2、用枯草芽孢杆菌接种空瓶：105和106各240瓶以上（杀菌喷嘴数的2倍），(接种量10l-100l)接种位置按照不同瓶型来定，尽量接种在瓶内凹陷不易杀菌的地方，在无菌线生产的所有瓶型都需做此验证3、空瓶正常风干后，准备进行测试，先做低浓度后做
15、高浓度，系统必须先做好COP/CIP/SOP/SIP，且无菌罐中准备好无菌水,4、测试前105和106的空瓶各随机抽取5个空瓶，到实验室进行阳性对照，其方法：到实验室将空瓶灌装100ml无菌水并充分振荡清洗，然后进行梯度稀释，至少稀释5个梯度，然后分别进行膜过滤，从而得出空瓶的初始带菌量5、将空瓶手动放入输送带进行杀菌（根据供应商所提供说明书用清洗灭菌条件的下限）、洗瓶、充填（充填无菌水200ml左右）、封盖，106的空瓶重复以上步骤6、将灌装好的产品到实验室充分振荡后依次进行膜过滤，培养后得出空瓶杀菌后残留菌量,瓶外挑战测试：1、准备在该线生产的空瓶100只以上2、用枯草芽孢杆菌接种空瓶：1
16、05接种100瓶以上，接种位置按照不同瓶型来定，尽量接种在瓶外凹陷不易杀菌的地方，接种后请用记号笔作好标致，在无菌线生产的所有瓶型都需做此验证3、空瓶正常风干后，手动挂到输送带准备测试，测试前系统需已做COP/CIP/SOP/SIP4、测试前随机抽取105空瓶5个，到实验室进行阳性对照，其方法：到实验室将空瓶接种处剪开放入已灭菌好的100ml无菌水的盒子中充分振荡清洗，然后进行梯度稀释，至少稀释5个梯度，然后分别进行膜过滤，从而得出空瓶的初始带菌量,5、空瓶经过正常的杀菌程序后（根据供应商所提供说明书用清洗灭菌条件的下限），取出到实验室将接种标志点剪出放入已灭菌好含有无菌水的盒子中充分振荡清洗
17、后膜过滤，或用已灭菌的棉签来涂抹接种标志点，将棉签放入放入已灭菌好含有无菌水的盒子中充分振荡清洗后膜过滤，从而得出瓶外杀菌后菌残留量瓶内外的验证判定方法和S5贴片试验的判定方法相同,S7盖内、外挑战测试,盖内挑战测试1、准备在该线生产的瓶盖200只以上2、用枯草芽孢杆菌接种瓶盖：105和106各100个以上，(接种量10l-100l)接种位置盖顶部、内封、外封、螺纹四个点均分（每个位置约25个左右），并做好区分标志3、瓶盖正常风干后，准备进行测试，先做105后做106，系统必须先做好COP/CIP/SOP/SIP，无菌罐中并存有无菌水,4、测试前105和106的瓶盖各随机抽取5个瓶盖，到实验室
18、进行阳性对照，其方法：到实验室将瓶盖分别放入装有100ml的无菌水中，进行充分振荡清洗，然后进行梯度稀释，至少稀释5个梯度，然后分别进行膜过滤，从而得出瓶盖的初始带菌量5、将瓶盖手动放入盖整列机，进行杀菌（根据供应商所提供说明书用清洗灭菌条件的下限）、冲洗、吹干、封盖，106的瓶盖重复以上步骤，建议接种盖子和未接种盖子用两种颜色盖子作区分6、将封盖后的产品（200ml无菌水）到实验室充分振荡后进行膜过滤，旋开的瓶盖（指盖螺纹处接种的盖子）也放入滤杯中清洗，培养后得出瓶盖杀菌后残留菌量,盖外挑战测试1、准备在该线生产的盖子100只以上2、用枯草芽孢杆菌接种瓶盖：105接种100个以上，接种位置盖
19、外部不易杀菌点，接种后请用记号笔作好标致3、瓶盖正常风干后，手工放入盖准备测试（接种盖和未接种盖颜色需做区分），测试前系统需已做COP/CIP/SOP/SIP,4、测试前随机抽取105瓶盖5个，到实验室进行阳性对照，其方法：到实验室将直接放入已灭菌好的100ml无菌水的盒子中充分振荡清洗，然后进行梯度稀释，至少稀释5个梯度，然后分别进行膜过滤，从而得出空瓶的初始带菌量5、瓶盖经过正常的杀菌程序（根据供应商所提供说明书用清洗灭菌条件的下限）后到实验室将瓶盖旋开直接放入已灭菌好含有无菌水的盒子中充分振荡清洗后膜过滤，或用已灭菌的棉签来涂抹接种标志点，将棉签放入放入已灭菌好含有无菌水的盒子中充分振荡
20、清洗后膜过滤，从而得出盖外杀菌后菌残留量盖内外的验证判定方法和S5贴片试验的判定方法相同,S8灌水测试,模拟正常生产，在正常的COP/CIP/SOP/SIP后，UHT生产无菌水，进行正常的无菌水灌装，至少灌装10000瓶以上，各时段分别取灌装好的无菌水样，生产前、中、后各50瓶，到实验室进行膜过滤；生产过程中要进行无菌水、无菌气的取样；生产结束后进行涂抹、落菌、浮游菌以及尘埃粒子的检测（其无菌水/气、涂抹、落菌尘埃等方法和S1 S3一样）,S9 LG培养基测试 一,1、参考LG培养基配制标准调配LG培养基，根据需要调配相应的吨数，经过UHT 138*32s杀菌后存放于无菌灌中2、新线、旧生产线
21、年度保养后（每年一次）、新瓶型/盖型的投产需进行此实验，系统在正常的COP/CIP/SOP/SIP后准备进行培养基灌装3、若是新瓶型则连续灌装10000瓶（5000瓶满瓶、5000瓶半瓶）4、若是新线、旧生产线的年度保养，开机灌装5000瓶（满瓶），24h后再灌装5000瓶（半瓶）5、培养基灌装后放入30-35的环境中保温，3天后将全部产品倒置，7天后进行全检，若没问题14天再进行全检,S10 LG培养基测试 二,1、参考LG培养基配制标准配置LG培养基20吨，经过UHT 138*32s杀菌后存放于无菌灌中2、系统在进行正常的COP/CIP/SOP/SIP后准备进行灌装3、开机灌装5000瓶（
22、半瓶）；第24h灌装5000瓶（半瓶）；第48h灌装10000瓶（5000瓶满瓶、5000瓶半瓶）；第72h灌装10000瓶（5000瓶满瓶、5000瓶半瓶）4、72h灌装结束后设备保持无菌状态待培养基测试三使用5、培养基灌装后放入30-35的环境中保温，3天后将全部产品倒置，7天后进行全检，若没问题14天再进行全检,S11 LG培养基测试 三,1、在培养基测试 二后继续进行，依次打开洗瓶、充填、封盖这三个区域的窗户一分钟，每次只能打开某区域的一扇窗户，然后进行正常的SOP后进行LG培养基灌装，灌装5000瓶（3000瓶半瓶、2000瓶满瓶）S11 LG培养基测试 三2、所有测试结束后，无菌罐
23、剩余培养基不要排放，继续维持无菌状态，存放120h后排放，排放口取样观察培养基是否变质3、培养基灌装后放入30-35的环境中保温，3天后将全部产品倒置，7天后进行全检，若没问题14天再进行全检,S12成品测试,1、生产线经过正常的COP/CIP/SOP/SIP后准备生产，产品（中性）正常生产前、中、后随机取样共100000瓶2、产品放入30-35的环境中保温，14天后全检3、成品微检、保温、常温取样30min/次；生产中无菌水、无菌空气/氮气需取样；生产结束涂抹、落菌、浮游菌检测（具体方法同S1、S3）,S0前提条件验收标准：所需检测点的预报警及其联动装置正常S1辅助系统S1辅助系统验收标准：
24、无菌水1cfu/1000ml 无菌空气1cfu/30min 无菌氮气1cfu/30min,S0-S12验收标准,S2烟雾测试标准：充填区向封盖区流；充填区向洗瓶区流；洗瓶区向杀菌区流动S3环境预测试标准落菌：1cfu/皿/30min；浮游菌：1cfu/皿/30min；涂抹：1cfu/棉签；尘埃粒子：充填、封盖、洗瓶达到100级 杀菌区达到1000级，风机检漏为0,S4染色试验验收标准：COP后干净、无可见的残留S5贴片测试验收标准：SOP杀菌能力RAVE5log 且 R MIN3.0log且3.0logR MIN4.0log的样品数量占比需2%的测试样品数量S6瓶内外挑战测试验收标准：瓶内杀菌
25、能力RAVE5log且 RMIN3.0 log且3.0logRMIN4.0log的样品数量占比需2%的测试样品数量；瓶外杀菌能力RAVE4log且 RMIN2.0log且2.0logR MIN3.0log的样品数量占比需2%的测试样品数量,S7盖内外挑战测试标准：盖内杀菌能力RAVE5log且 RMIN3.0log且3.0logRMIN4.0log的样品数量占比需2%的测试样品数量；盖外杀菌能力RAVE4log且 RMIN2.0log且2.0logR MIN3.0log的样品数量占比需2%的测试样品数量 S8灌水测试标准：灌装的无菌水产品膜过滤不得有菌检出;无菌水、无菌空气、涂抹、落菌、浮游菌
26、都不得有菌检出；空间洁净度：充填、洗瓶、封盖区为100级，杀菌区为1000级,S9培养基测试一验收标准：变质品1瓶S10培养基测试二验收标准：变质品3瓶，且第72h灌装的10000瓶中变质品1瓶S11培养基测试三验收标准：a、变质品1瓶b、120h后无菌罐中的培养基排放取样观察无变质S12成品测试验收标准：a、100000瓶产品放入30-35的环境中保温，14天后全检，变质品1瓶b、成品微检、无菌水/气、涂抹、落菌全部不得有菌检出c、尘埃粒子：充填、封盖、洗瓶达到100级 杀菌区达到1000级,注意事项,1、枯草芽孢杆菌的购入需有第三方检验报告，购回的菌种菌液浓度确定，详见附件一；钢片、空瓶、
27、盖的挑战测试中所接种菌量105、106都是指风干后钢片、瓶、盖上的带菌量，所以接种时需注意考虑到风干的损失（一般接种至风干枯草芽孢菌量损失一个梯度左右）2、在钢片、瓶、盖的挑战测试中所有样品的膜过滤菌落计数只计枯草芽孢杆菌，其他杂菌一律不做考虑，请操作中尽量小心，避免太多的杂菌带入,3、贴片试验、瓶、盖的挑战试验中涉及到枯草芽孢杆菌接种，请注意：接种不要直接在实验室，尽量选择单独的屋子（垃圾场、污水处理处等选一间）避免污染，接种的屋子里尽量保持干燥（可以在屋子里放一些石灰）；在现场（风轨、盖槽等）以及实验室做完试验后请立即消毒，避免污染；计数后含有枯草芽孢的平皿需121*30min灭菌后再作处
28、理。4、钢片试验、瓶、盖的挑战测试以及微生物培养基验证的所有运行参数需做详细记录，包括瓶、盖杀菌剂的浓度杀菌时间、中间SOP间隔时间、浓度等，若培养基测试通过此参数即作为日后量产的一个参考标准,附件：LG培养基配置标准,1.调配配方（10000L）葡萄糖(生物级)200kg 酵母提取物(生物级)35kg 蛋白胨(生物级)20kg 硫酸铵(食品级)20kg 磷酸二氢钾(食品级)10kg 硫酸镁(食品级)10kg RO水 约9500kg 碳酸氢钠(食品级)适量,2.调配步骤2.1向调配桶中加入5000L纯净水2.2将20kg蛋白胨用800L60的纯净水在高搅桶中预混（搅拌5分钟直至蛋白胨彻底溶解）
29、，通过滤网(25m)加入调配桶中。2.3向高搅桶中加入1000L常温纯净水，开启搅拌器将其余组分按下列次序加入：酵母提取物 35kg 葡萄糖 200kg 磷酸二氢钾 10kg 硫酸铵 20kg 硫酸镁 10kg,2.4搅拌10分钟直至所有组分彻底溶解后打入调配桶中2.5调配桶搅拌10分钟，用碳酸氢钠调至所需PH并补加水至10000L2.6取样检测，要求：感官清澈，透明，无异物；pH值(6.10.2)；温度（30）。2.7 LG培养基杀菌条件：138*32s 3注意事项3.1 配制前应根据RO水的pH来测试估算碳酸氢钠的添加量，RO水的pH控制在之间。3.2若培养基所需用量不为10000L,按此调配配方比例调整。3.3培养基贮存时间:2小时,贮存时温度30,
