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1、1,第 10 章 基因诊断 Gene diagnosis China Medical University Department of Medical Genetics,p480,2,本章内容提示,基因诊断概念 基因诊断方法 直接诊断（Southern）间接诊断（PCR-RFLP）DNA多态 基因诊断 实例：,3,第一节 基因诊断技术 第二节 基因诊断方法及实例,4,基因诊断：利用分子生物学技术从DNA 水平检测人类遗 传性疾病的基因缺陷，又称DNA分析法。传统的诊断：表现型基因型 基 因 诊 断：基因型表现型（逆向诊断）,5,基因诊断的特征：,1 不受材料来源影响 外周血、活体穿刺组织、孕妇
2、外周血、血斑等2 症状前诊断 尤其对于一些延迟显性疾病如Huntingtong舞蹈病3 产前诊断 避免患儿出生，提高人口质量,6,第一节 基 因 诊 断 技 术,Southern印迹杂交,7,基 因 诊 断 技 术,Northern印迹杂交,8,基 因 诊 断 技 术,斑 点 杂 交,点样,Probe-32P,检测,AB,1 2 3 4,9,基 因 诊 断 技 术,荧光原位杂交,10,基 因 诊 断 技 术,荧光原位杂交,11,基 因 诊 断 技 术,聚合酶链反应,12,基 因 诊 断 技 术,聚合酶链反应,13,基 因 诊 断 技 术,多重PCR,在一个PCR体系中加入数对PCR引物，覆盖区
3、域不重叠用于检测同一基因多个外显子的缺失,E1 E2 E3,14,基 因 诊 断 技 术,RT-PCR,以mRNA为模板，经逆转录酶合成cDNA用于研究基因表达使微量mRNA迅速扩增，提高mRNA检出的灵敏度,15,基 因 诊 断 技 术,PCR-SSCP（Single Strand Conformation Polymorphism）,单链DNA由于碱基序列不同可引起构象差异，这种差异将造成相同或相近长度的单链DNA电泳迁移率的不同。据此，可用于DNA中单个碱基的替代、微小的缺失或插入的检测。,16,基 因 诊 断 技 术,-primer-32P-dNTP掺入 PCR扩增 产物 变性 单链D
4、NA 中性聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 2 3 4 5 自显影 1为正常 结果分析 2、4、5为纯合患者 3为杂合子.,17,基 因 诊 断 技 术,生 物 芯 片,18,第二节 基 因 诊 断 方 法及实例,直接诊断直接检测致病基因的突变 基因突变类型缺失、点突变、重复、插入等,间接诊断应用DNA多态为遗传标记进行连锁 分析，确定待测者是否得到带有致病的染色体，从而间接地作出诊断 DNA多态RFLP、VNTR、SNP,19,一 DNA多态,DNA多态（DNA Polymorphism）：群体中每个个体DNA区域中等位基因（或片段）存在两种或两种以上的形式，对基因功能没有影响，称DNA多态。它通过孟
5、德尔方式遗传。常用做遗传分析中的标记。,20,DNA分析中常用的遗传性多态性标记有3类：,1）RFLP：称限制性片段长度多态性，为第一代多态性标记；2）重复序列多态性（VNTR）：如短串联重复序列（STR），为第二代多态性标记；3）单碱基多态性（SNP）：DNA序列的单个核苷酸的差别，为第三代多态性标记。,21,一)限制性片段长度多态性,Restriction Fragment Length Polymorphism，RFLP由于碱基变异可能导致限制酶切点消失或新的酶切点出现，引起不同个体DNA在用同一限制酶切割时，产生不同长度的DNA片段，称 RFLP RFLP按孟德尔（共显性）方式遗传，是
6、非常有用的遗传标记。,22,Allele II 产生了新的酶切点,Allele I,Allele II,12Kb,8Kb,4Kb,probe,12Kb,8Kb,RFLPSouthern blot检测结果,23,AlleleII酶切位点消失,24,二)数目变异串联重复，variable number tandem repeats,VNTR）,重复序列以各自的核心序列（重复单元），首尾相连多次重复，称为串联重复序列，其重复次数在人群中存在变异，形成多态即 VNTR。散在分布于染色体上。重复单位625bp长，称为小卫星DNA。重复单位26bp长，如（TA）n,(CGG)n等，称为微卫星DNA。,25
7、,VNTR两侧酶切位点固定，但两酶切点之间的串联重复拷贝数不同，酶切后产生不同长度的片段。DNA多态可以通过PCR扩增后电泳来检出，称扩增片段长度多态（amplified fragment length polymorphism,Amp-FLP）,26,VNTR 酶切，电泳后的检测结果,大,小,27,PCR-VNTR检测,28,PCR-VNTR,29,30,三)单核苷酸多态性（SNP）（Single Nucleiotide Polymorphism）,SNP：发生在基因组中的单个核苷酸的替代根据SNP在基因中的位置，分为：基因编码区SNP 基因周边SNP 基因间SNP在人类基因组中每10030
8、0个核苷酸就有一个SNP,31,二、基诊断方法及实例,直接检测致病基因本身的异常。通常使用基因本身或邻近DNA序列作为探针，进行Southern 杂交，或通过PCR 扩增产物，以检测基因点突变、缺失、插入等异常及性质。主要适用于已知基因异常疾病的诊断。,直接基因诊断及实例,32,直接基因诊断 突变型遗传病的直接基因诊断,e.g.镰形细胞贫血的Gene诊断,33,1）Southern blot 珠蛋白链基因第6位密码子发生突变 GAGGTG 谷Aa缬Aa,e.g.镰形细胞贫血的Gene诊断,34,已知限制酶Mst 1识别序列（CCTNAGG）CCTGAGG CCTGTGG突变后不能识别，酶切位点
9、消失，限制酶切片段长度发生变化。,35,2)ASO探针诊断,已知突变Gene部位和性质，合成寡核苷酸探针，32P标记，进行斑点杂交。Normal Gene Probe与正常 Probe 杂交稳定 Mutation S Gene Probe与异常 S杂交 稳定,36,等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO）（Allele-specific-oligonucleotide）,37,斑点杂交结果：,/S S/S 正常探针 突变探针,突变型遗传病的直接基因诊断,38,突变型遗传病的直接基因诊断,39,BamHI,BamHI,2,1,2,10 kb,14 kb,probe,1）地中海贫血的基因诊断,基因不同
10、程度的缺失可引起不同类型的地中海贫血。,直接基因诊断 缺失型遗传病的直接基因诊断,40,Southern blot 检测结果：,/-/-/-/-正常 缺1 缺2 缺3 缺4,14kb,10kb,缺失型遗传病的直接基因诊断,41,2）地贫的Gene诊断珠蛋白基因两侧有pst1酶切位点，pst1酶切正常可得到4.4kb片段珠蛋白基因缺失0.7kb片段，pst1酶切则得到3.7 kb片段为0,缺失型遗传病的直接基因诊断,42,以Gene为探针，Southern blot 方法检测,/A/0 0/0,4.4kb,3.7kb,缺失型遗传病的直接基因诊断,43,3）DMD的基因诊断,DMD属XRDMD基因
11、是最大的基因，有79个外显子DMD基因突变主要以缺失为主，可涉及基因的不同部位,E1 E2 E3,缺失型遗传病的直接基因诊断,44,病例,外显子,1 2 3 4 5 6 7 8,Pm34350136476052,bp,535,113,缺失型遗传病的直接基因诊断,45,二）间接基因诊断方法及实例,当致病基因虽然已知，但其异常性质未知时，或疾病Gene本身尚未知时，主要通过Gene和DNA多态的连锁分析间接地作出诊断。,46,连锁分析基于遗传标记与Gene在染色体上连锁，通过对受检者及其家系进行连锁分析，分析子代获得某种遗传标记与疾病的关系，间接推断受检子代是否获得带有致病基因的染色体，间接地判断
12、并做出诊断。遗传标记是基因组中的DNA 多态 如：RFLP，VNTR 等。,间接基因诊断,47,遗传标记,相关基因,表型分析,间接基因诊断,48,1 Southern blot-RFLP诊断(PKU),PAH基因两侧有Msp1酶切位点,用该酶消化可产生23kb、19kb 两种等位片段，以PAHcDNA为探针与PKU家系成员外周血DNA杂交。,间接基因诊断,49,患者为19kb片段的纯合子,说明患者缺陷的PAH基因与19kb片段连锁其父、母亲缺陷的PAH基因与19kb片段连锁，其23kb片段与正常PAH基因连锁。II2为23kb 和19kb片段的杂合子，为表型正常的致病基因携带者。,间接基因诊断
13、,50,2 成年型多囊肾病的诊断,例：成年型多囊肾病APKD，AD，临床表现为腰痛，蛋白尿，血尿，高血压，肾盂性肾炎，肾结石。最终导致肾功能衰竭和尿毒症。APKDGene定位16p13，但致病基因尚未克隆，基因产物的生化性质和疾病发病机理也尚未阐明，但已证实APKD Gene与珠蛋白基因3端附近的一段小卫星DNA序列（3HVR）紧密连锁，因此，可以通过连锁分析进行诊断。,间接基因诊断,51,以3HVR为探针，与PvuII酶切后的家系有关成员的基因组DNA进行Southern Blot,基因组DNA,PvuII酶切,DNA片段,变性,转膜,探针,变性,杂交,结果分析,间接基因诊断,52,1 2
14、1 2 3 4 5 5.7kb 3.4kb 2.3kb,间接基因诊断,53,结果分析,患者（I1、II1和II2）有3.4kb片段，说明致病基因与3.4kb片段连锁，并按孟德尔方式遗传。II5不含3.4kb片段，产前诊断正常。,间接基因诊断,54,3 甲型血友病诊断（PCRRFLP）,甲型血友病的基因诊断：已知甲型血友病XR，获得家系成员基因组DNA。PCR 142 bp BcLI 142bp 99 bp 43bp 电泳 结果分析,p1,p2,142bp,99bp,43bp,Bcl I,Bcl I-,Bcl I+,间接基因诊断,55,间接基因诊断,56,142bp,99bp,1 2,1,2,3
15、,III,1,间接基因诊断,57,结果分析,1）先症者II 1具有99bp片段而发病，该片段来自母亲。2）II2有142bp/99bp，为杂合子。142bp来自父亲，为正常片段，99bp片段是来自母亲而成为携带者。3）1为99bp片段 如果是 男性 为患者（99bp片段来自母亲）；女性为携带者（来自父母双方）,间接基因诊断,58,单体型分析,有时用一种酶和一个探针不能提供可供分析的信息，需采用一种以上的酶结合几个基因探针杂交分析。根据同一条染色体上限制性位点的丢失或获得而出现的一组多态位点所构成的不同片段长度的组合类型进行分析，该分析方法称单体型分析（Haplotyping),间接基因诊断,5
16、9,举例：PKU家系Hind 酶切：患儿4.2/4.0kb杂合体 父母4.2/4.0kb杂合体 均为杂合体，无法分析。再用sph酶切：患儿 纯合7.0kb 父亲 纯合7.0kb 母亲 9.7kb和7.0kb杂合体,间接基因诊断,60,结 果,1 2 1 2 3 4.2kb 4.0kb 11kb 9.7kb 7.0kb,I,II,Hind,Sph,间接基因诊断,61,分析：患儿1从母亲和父亲各获得一个7.0kb突变型从Hind 酶切结果看出：正常同胞3为纯合4.0kb，也是sph 7.0kb纯合体，故母亲H 4.0kb S 7.0kb 构成单体型，母亲7.0kb为突变型，因此，母亲H 4.0kb S 7.0kb为突变单体型。,间接基因诊断,62,患儿1为Hind 4.2/4.0kb杂合体，故父亲H 4.2kb S 7.0kb 为突变单体型母亲H 4.2kb S 9.7kb 和父亲H 4.0kb S 7.0kb 为正常单体型。2 两个单体型分别为H 4.2kb S 9.7kb（母）和H 4.0kb S 7.0kb（父）正常个体3两个单体型分别为H 4.0kb S 7.0kb（母）和H 4.0kb S 7.0kb（父）携带者,间接基因诊断,63,基因诊断意义,现症病人的诊断：争取有效、针对性治疗。产前诊断：意义更为重要，预防遗传病患儿的出生,END,
