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1、,第12章 杂交瘤技术与单克隆抗体,新民周刊,：世界肺炎日（第2个）全球每年约有160万人死于肺炎链球菌疾病，平均每38秒1名5岁下儿童死于此病，1100万儿童因肺炎住院。,中国是10个肺炎发病率最高的国家之一，1/4儿童携带病菌；死亡儿童该病占46.8%。占西太平洋区的70%。,红霉素不敏感几乎达到100%，青霉素达86%。,1983年23价肺炎链球菌夾膜多糖疫苗PPV23诞生。2000年针对2岁以下儿童的7价肺炎链球菌蛋白结合疫苗PPV7问世。目前已经接种3亿剂，世界第一大单个疫苗。,2003年 SARS病毒,SARS病毒属于冠状病毒科，病毒粒子多呈圆形，有囊膜，外周有冠状排列的纤突，病毒
2、直径在80-120nm之间。,感染病毒的细胞线粒体肿胀，部分线粒体外膜或嵴溶解，病毒颗粒主要分布在胞浆的内质网池、胞浆空泡内和细胞外，多聚集成堆。,HIV病毒-艾滋病,HIV是艾滋病病毒（human,immunodeficiency virus）的缩写。“人类免疫缺陷病毒”。逆转录病毒，遗传信息存在于两个相同的RNA单链模板中。艾滋病是1981年发现的。,生存于人的血液中并攻击人体免疫系统。把人体免疫系统中最重要的T4淋巴细胞作为攻击目标，大量吞噬、破坏T4淋巴细胞，从而使整个人体免疫系统遭到破坏，最终人体丧失对各种疾病的抵抗能力而导致死亡。,12-1 杂交瘤技术,将骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细
3、胞融合得到即能够分泌抗体又能在体外长期繁殖的杂交瘤细胞，经过克隆化培养得到可以分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞，这种技术通称为杂交瘤技术（hydridomatechnique）。,历史发现,1975年，英国剑桥大学分子生物学研究室将已适应于体外培养的小鼠骨髓瘤细胞与绵羊红细胞免疫小鼠脾细胞（B淋巴细胞）进行融合，发现融合形成的杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征：即像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能够无限地快速增殖，又能持续地分泌特异性抗体。,科勒（Kohler）,米尔斯坦（Milstein）,（一）免疫学基础,1 抗原：,进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。,包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细
4、菌、各种细胞等。,特点：结构表位性（抗原决定簇）,12-2 单克隆抗体,免疫原特异性：（抗原与抗体的反应）抗原-刺激免疫系统-发生免疫应答-产生应答产物。,抗原的表位,抗原决定簇:(antigen determinant）；,又称为表位（epitope）。,存在于抗原分子表面的，能与淋巴细胞表,面特定受体或其分泌的抗体相结合的特殊化学基团，称为抗原决定簇或表位。,18,T细胞与B细胞抗原决定簇的比较,2 抗体,互补性决定区（Complementaritydetermining region，CDR）VH和VL的三个高变区共同组成Ig的抗原结合部位。该部位形成一个与抗原决定簇互补的表面，决定抗体
5、的多样性与特异性。,动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的物质，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。,C：constant region V：variable region,抗体的来源,免疫系统：包括体液免疫和细胞免疫，参与的细胞包括,B淋巴细胞发育成浆细胞，分泌抗体，参与体液免疫，脾脏可以分泌。,T淋巴细胞发育成吞噬细胞，直接参与细胞免疫，经胸腺分泌。不能产生抗体，帮助B淋巴细胞产生抗体。,（二）多克隆抗体与单克隆抗体概念,单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb)：经过免疫的哺乳类动物单一的B淋巴细胞可以分泌单一性抗体，把这种具有
6、特异性的、同质性的抗体称为单克隆抗体。P126动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，它针对抗原上的一个抗原决定族产生的抗体，一个B细胞就是一个克隆，故称为单克隆抗体。,一种抗原通常具有多个不同的抗原决定族，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。,问题的引出,血液得到的只能是混合抗体，但是需要大量的仅针对某一个抗原决定族的单克隆抗体，几乎是不可能的，因此必须采用其他方法。,3 单克隆抗体生产途径：细胞融合：杂交瘤细胞 病毒转化：获得永久生长的B淋巴细胞,视频：,http:/d_XMTY1ODg5MDI0.html,(三）杂交
7、瘤制备单克隆抗体,单克隆抗体技术,分非特异性、特异性两类,1.动物免疫与免疫脾细胞悬液的制备,体外法：用抗原免疫离体的淋巴细胞，3-4d收获。体内法：一般要经过初次免疫、第二次免役（向动物腹腔内注射抗体）、加强免疫（向动物静脉内注射抗体）3个过程。如果需要免疫脾细胞，一般取最后一次加强免疫3天以后的脾脏，用无血清的培养液制备成B细胞悬液。,2.骨髓瘤细胞株的培养与筛选,骨髓瘤细胞系应和免疫B淋巴细胞源于同一品系动物（如BALB/C小鼠），这样杂交融合率高。,通常采用HPRT（次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶）与TK（胸腺嘧啶核苷激酶）缺陷型的骨髓瘤细胞系。HPRT和TK两种酶参与DNA补救途径合成
8、。,一般在准备融合前的两周就应开始复苏骨髓瘤细胞，用老鼠巨噬细胞作饲养层进行培养，取对数生长期骨髓瘤细胞，进行HAT液敏感性筛选培养。,HAT培养基筛选法,培养基中有三种关键成分：次黄嘌呤,（hypoxanthine，H）、氨基蝶呤,（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷,（thymidine，T），所以取三者的字头称为HAT培养基。,HAT筛选原理,DNA的合成：,正常途径：糖、氨基酸核苷酸DNA，可以被氨基蝶呤阻断,胸腺嘧啶核苷激酶（TK）,补救途径：核苷酸前体 核苷酸DNA次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HPRT）,需要2种酶的参与,3.细胞融合,（1）将对数生长的骨髓瘤细胞与脾B淋
9、巴细胞按1：10或1：5的比例混合在一起，在50ml塑料离心管内用不完全培养液（无血清）洗1次，离心，弃上清，用滴管吸净残留液体。,（2）30秒内加入预热37 的50 PEG，边加边搅拌，在37 下融合。加预热的不完全培养液，终止PEG作用。,（3）离心，留细胞沉淀，用HAT培养液轻轻混悬。将融合后细胞悬液加入96孔板，100l,孔，37、5CO2培养箱培养。8-12d后进行抗体检测。,4 融合细胞的筛选,融合的B淋巴细胞和瘤（杂交瘤）细胞、融合的B淋巴细胞、融合的瘤细胞、未融合的B淋巴细胞、未融合的瘤细胞以及细胞的多聚体等。,正常的B淋巴细胞在培养基中存活仅57天，无需特别筛选，细胞的多聚体
10、形式也容易死去。,剩余：B淋巴细胞与瘤细胞的杂交瘤细胞+未融合的瘤细胞+融合的瘤细胞，其中后两种需进行特别的HAT液培养筛选去除。,融合后的细胞类型：,（1）氨基蝶呤可阻断细胞正常途径合成DNA，因此HAT培养基上的细胞不能采用该途径合成DNA。（2）融合的瘤细胞一般是HPRT与TK缺陷型，因此也不能采用补救途径合成DNA。两条途径被阻断后，有怎样的结果呢？,瘤细胞（未融合的和多聚体）命运：因不能正常合成DNA而死亡。,融合杂交瘤细胞：具有亲代双方的遗传性能，具有来自于淋巴细胞内的HPRT与TK，因此可利用培养基中的嘌呤与嘧啶采用补救途径合成DNA，因此可在HAT培养基中存活与繁殖。,HAT筛
11、选杂交瘤细胞,H,次黄嘌呤;A,氨基喋呤;T,胸腺嘧啶,5.杂交瘤细胞的克隆化培养,将融合的杂交瘤细胞进行充分稀释，使分配到培养板的每一孔中的数个细胞之间，培养。,取上清以ELISA法筛选出针对目标抗原的抗体分泌性高的杂交瘤细胞株，增殖后冻存。,6 抗体鉴定：酶联免疫吸附法（ELISA）检测,在测定时，把受检标本（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成的抗原抗体复合物，加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。,7.单克隆抗体的大量制备,（1）血清法,对数生长期的杂
12、交瘤细胞按13107cellsml接种于小鼠背部皮下，每处注射0.2 ml。待肿瘤达到一定大小后(一般1020天)则可采血，从血清中获得单克隆抗体含量可达到1-10mgml。缺点是采血量有限。,（一）体内接种法,（2）腹水制备法,腹腔注射1106个杂交瘤细胞，接种细胞710天后可产生腹水，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获110ml腹水。也可用注射器抽取腹水，可反复收集数次。,腹水中单克隆抗体含量可达520mg/ml，这是目前最常用的方法。,常用生物反应器培养杂交瘤细胞大规模生产单抗,杂交瘤细胞生物反应器培养液,离心除去细胞，收集上清液提取抗体。,（二）体外培养法,12-3 人
13、源化单克隆抗体,鼠源性单抗仍带有鼠抗原决定簇而使其应用存在一定的局限性:,（1）不能有效地激活人体中补体和Fc 受体相关的效应系统,（2）被人体免疫系统所识别,产生人抗鼠抗体,(Human antigen mouse antibody,HAMA),（3）在人体循环系统中很快被清除掉。,通过人源化改造获得低免疫原性、高效性、人源性单克隆抗体，解决鼠杂交瘤单抗用于人体的变态反应的问题。但是进展很慢。,人鼠杂交瘤：融合方法基本与鼠鼠杂交瘤相同。亲本骨髓瘤细胞是小鼠骨髓瘤细胞，亲本B细胞则来源于人外周血淋巴细胞、淋巴结细胞、脾细胞。但是，人鼠杂交瘤的人单克隆抗体分泌性能很不稳定，多数情况下杂交瘤会很快失去抗体分泌能力。人人杂交瘤：可通过建立人骨髓瘤或其他人细胞系与人淋巴细胞融合来制备人单克隆抗体。人源性融合亲本细胞需具有较高的融合率、产生的杂交瘤核型稳定并能产生一定量的具有特异性的抗体等特征。人人杂交瘤核型稳定，然而遗憾的是可供利用的人类骨髓瘤细胞种类非常有限。,课外学习视频：单克隆抗体制备,
