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1、谷胱甘肽转硫酶的制备及动力学研究,实验内容：（一）亲和层析法制备谷胱甘肽转硫酶（二）测定酶活力、米氏常数和最大反应速度（三）Folin-酚法测定蛋白质含量，计算比活力,（一）测定酶活力的原理,酶促反应速度：酶促反应体系复杂，影响酶促反应速度的因素很多，包括底物浓度、酶浓度、产物浓度、pH、温度、抑制剂和激活剂等影响因素。酶促反应速度通常用在一定条件下，以单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示，用产物浓度对反应时间作图，得到酶促反应速度曲线。,从图中可以看到，反应速度只在最初一段时间内保持恒定，随着反应时间的延长，由于底物浓度降低，产物反馈抑制，逆反应速度加快，酶本身失活等因素，使酶促反应速
2、度逐渐下降，最后完全停止。在测定酶促反应速度时，要避免以上干扰因素，必须在酶促反应初期进行，在最初这段时间内的反应速度称之为反应初速度，在过量的底物存在下，反应初速度与酶浓度成正比。在酶促反应速度曲线上，过原点做切线，其斜率即为初速度。酶促反应速度的单位是：浓度/单位时间。,酶活力 是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力单位定义为：在一定条件下，一定时间内，将一定量的底物转化为产物所需要的酶量，酶活力的大小即酶含量的多少。通常用最适条件下酶所催化的某一化学反应的反应速度来衡量酶活力的大小，酶催化的反应速度越大，酶活力越高，反之，酶活力越低，所以酶活力的测定就是测定酶促反应的速度，即单位时间内底物
3、或产物的浓度变化。国际单位 酶活力单位统一用国际单位（international unit，简写为IU）来表示，规定：在最适反应条件（25，最适缓冲液离子强度和pH值，最适底物浓度）下，每分钟内催化1 mol底物转化成为产物所需要的酶量为一个国际单位，即1IU=1mol/min。比活力 为每毫克蛋白质所具有的酶活力单位数，一般用酶活力单位/mg蛋白质表示。酶的比活力在酶学研究中用来衡量酶的纯度，对于同一种酶来说，比活力越大，酶的纯度越高。利用比活力的大小可以用来比较酶制剂中单位质量蛋白质的催化能力，是表示酶的纯度高低的一个重要指标。,酶活力的测定 酶活性的测定应贯穿于酶分离纯化过程的始终。在酶
4、的分离纯化过程中的每一个步骤前后，通过测定酶活力，了解总活力的回收和比活力提高的倍数，为我们选择适当的分离纯化的方法和条件提供直接的依据。酶分离纯化的效果可以用总活力的回收率和比活力提高的倍数作为指标，总活力损失少、比活力提高倍数多即为有效的纯化方法。酶活力的测定一般是通过测定酶促反应的速度而确定，而酶催化的反应速度可用单位时间内产物的增加量或底物的减少量来表示。测定方法主要是根据产物或底物的物理化学特性来决定具体的测定方法，分光光度法具有操作简便，时间短，灵敏度高等优点，是一种最重要的酶活力的测定方法。,本实验采用1-氯2，4-二硝基苯（CDNB）和还原型谷胱甘肽作为酶的底物，分光光度法记录
5、酶促反应生成产物GS-DNB引起的光吸收增加值，通过在340nm连续测定反应过程中产物光吸收值的变化，做出光吸收时间曲线，从而计算出酶活力。反应式为：,（二）测定Km 和V的原理,Km和最大反应速度是酶的特征常数，不同的酶Km和 V不同，受底物、pH、温度、离子强度等因素的影响。将米氏方程的形式加以改变，可以得到几种方程形式，在特定条件下测得不同底物浓度S时相应的初速度v，用作图法测定Km和V。米氏方程是从单底物酶促反应推导出来的，但实际上这种反应很少。在多底物反应中，如果只有一种底物浓度发生变化，其他底物浓度保持不变，那么就可以将它看成单底物反应，利用米氏方程的几种形式测定Km和V值。本实验
6、采用终止法，即在酶和底物反应达到预定的时间（1min）时，立即加入强酸终止酶促反应，在这段反应时间里产物的生成量基本呈线性增加，用这段反应时间内的平均速度代替反应初速度，利用作图法，可以很方便地求出Km和V。,操作步骤,实验用具（一组）：加样器(200L)：CDNB、GSH(60mmol/L)、酶 1mL注射器（塑料）：TCA（测定Km和V 时使用）比色杯：2个 秒表：1块（测定Km和V 时使用）试剂（一台）：PB：40m L CDNB、GSH（60mmol/L）、TCA：小离心管 GSH（2mmol/L）：10m L调整分光光度计的参数：wavelength：338nm delay time
7、：30秒 cycles：8,（一）酶活力的测定 室温条件下测定，调好紫外分光光度计，取两个比色杯，按下表加样：,测定步骤,1.两个比色杯分别加入PB、底物CDNB和GSH（60mmol/L），混匀；2.放在分光光度计中的空白和“1”位上，注意光路方向，按“zero base”，等待仪器校零；3.将“1”位上的比色杯拿出，加入酶的同时按“run”，立即混匀，放入分光光度计中；4.仪器自动读8个数（30s读一次），共反应4min。,注意事项,1.酶液的稀释：取部分酶液用PB稀释510倍，混匀。2.磷酸缓冲液：加入PB的量与酶量有关，要求终体积为3mL。3.加酶量：要求A340nm/min（第二个数
8、）在0.20.5之间，否则需要调整加酶量重新测定。4.空白：第二组或重做时，空白比色杯不动，只需将“1”位上比色杯重新测定。5.重做：只需将“1”位比色杯洗净，加入缓冲液和底物，混匀，校零，加酶，“run”，混匀，测定。,数据处理,做出时间-光吸收关系曲线，过原点做切线，求出A340nm/min，计算酶活力。酶活力的定义：在一定反应条件下，每分钟内催化1 mol底物转化成为产物所需要的酶量为一个单位，即1IU=1mol/min。计算公式为：式中A为每分钟光吸收的变化值，v为酶促反应体积(3mL)，为产物的消光系数(9.6L/mmolcm)，L为比色杯的光程(1cm)。,（二）Km和V的测定 取
9、六支试管，按下表加样：,测定步骤,1.每根试管加入CDNB、GSH（2mmol/L）、PB后，加入酶，同时用秒表计时，立即混匀，静置，1分钟时加入50%的TCA，混匀，终止反应；2.将仪器 delay time调为0，cycles调为1，空白同酶活性测定，用0试管溶液放在“1”位上校零，测定其他各管的吸光值。,注意事项,1.酶液的稀释：酶的稀释倍数与酶活力测定一致。2.磷酸缓冲液：加入PB的量与酶量有关，要求终体积为3mL。3.加酶量：根据前面酶活力的测定决定加酶量，使A340nm/min在0.050.5之间。4.仪器参数调整：将delay time调为0，cycles调为1。5.空白：测定酶活力的空白比色杯不动，只需将“1”位比色杯加入0试管的溶液校零，然后依次测定15试管中溶液的吸光值。,数据处理,计算出各种作图法需要的数据，用几种直线方法作图，根据横、纵截距求出米氏常数和最大反应速度。S=GSH（3mL反应体系中的底物浓度）1/S=1/GSH v=/A340nm S/v=GSH/v,
