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1、Enzyme and Vitamins,酶与维生素,第 三 章,酶 学,ENZYME,第 二 部 分,一、概念,酶是对其特异底物具有高效催化作用的蛋白质和核糖核酸。,概 论,酶学研究的意义,二、酶学研究简史,公元前21世纪，中国已有酿酒记载；,1833年，Payen&Persoz 发现淀粉酶(diastase)；,二、酶学研究简史,19世纪，对酶的知识来源于发酵过程的研究；,1878年,Kuhne首次提出Enzyme一词；,1897年,Buchner兄弟用酵母提取液实现了发酵；,1913年,Michaelis和Menten提出了“米氏方程”,二、酶学研究简史,1926年，Sumner首次从刀豆
2、中提纯出脲酶结晶；,二十世纪中叶，酶学的迅速发展；,1982年，Cech提出核酶(ribozyme)的概念；,1986年，Lerner和Schultz研制出抗体酶(abzyme)；,1995年，Jack W.Szostak报道了脱氧核酶。,酶结构与催化机理的研究：促进分子生物学及技术的发展。,酶的分子结构与功能,第一节,The Molecular Structure and Function of Enzyme,一、酶的分子组成及分类,结合酶(conjugated enzyme),单纯酶(simple enzyme),基本组成仅为氨基酸的一类酶。,由蛋白质和非蛋白两部分组成。,(一)根据酶的组
3、成成分,辅助因子分类：,辅酶(coenzyme):,辅基(prosthetic group):,按其与酶蛋白结合的紧密程度分为,与酶蛋白结合疏松，可用透析或超滤的方法除去。,与酶蛋白共价结合，不能用透析或超滤的方法除去。,金属离子：,与酶结合紧密，提取过程中不易丢失。如Fe2+、Fe3+、Cu2+、Zn2+、Mn2+、Co3+过渡金属离子。,约2/3的酶催化活性需要金属离子。,金属酶(metalloenzyme),金属激活酶(metal-activated enzyme),为酶的活性所必需，但与酶的结合不甚紧密。如Na+、K+、Mg 2+、Ca 2+碱和碱土金属离子。,稳定酶的构象；参与催化反
4、应，传递电子；酶与底物间起桥梁作用；电荷屏蔽作用，降低反应中的静电斥力等。,金属离子的作用,金属离子的电荷屏蔽作用,激酶的底物Mg2+-ATP，Mg2+屏蔽磷酸基的负电荷，减少具有阴离子性质的电子对攻击亲核体。,腺嘌呤核糖,传递电子、质子或其它基团的运载体的作用。,酶的种类繁多，辅酶(辅基)数目有限。酶蛋白决定反应的特异性，辅酶(辅基)决定反应的种类和性质。大多数水溶性维生素作为辅酶或辅基。,小分子有机化合物的作用,特点,小分子有机化合物在催化中的作用,(二)根据酶的结构特点及分子组成形式,多功能酶(串联酶)：一些多酶体系在进化过程中由于基因的融合，多种不同催化功能存在于一条多肽链中。,单体酶
5、：,单一肽链仅具有三级结构的酶。,寡聚酶：,多个相同或不同亚基组成的酶。,多酶体系：,几种不同功能的酶彼此聚合形成的多酶复合物。,以一定次序结合，形成催化作用的“流水线”。,(三)根据酶的存在状态,在合成后分泌到细胞外发生作用的酶,胞内酶：,在合成分泌后定位于细胞内发生作用的酶,大多数的酶属于此类。,胞外酶：,主要为水解酶。,二、酶的活性中心,酶分子中，与酶活性密切相关的化学基团。,必需基团(essential group),酶的特殊催化能力只局限在大分子一定的区域，既只有少数氨基酸残基参与底物结合和催化作用。,结合基团(binding group),与底物相结合,催化基团(catalytic
6、 group),催化底物转变成产物,活性中心外的必需基团,位于活性中心以外，维持酶活性中心空间构象所必需。,酶分子中 必需基团在一级结构上可能相距甚远，甚至位于不同的肽链上，通过肽链的盘绕、折叠而在空间结构上彼此靠近，组成具有特定空间结构的区域，能与底物特异结合并将底物转化为产物。,酶的活性中心(active center),酶的活性部位(active site),结合酶：辅酶或辅基往往是活性中心的组成成分。,溶菌酶的三维结构及酶-底物复合物,催化基团：,Glu35和Asp52；,结合基团：,Trp62和63、Asp101、Trp108,129个氨基酸残基,某些酶活性中心的催化基团,思考题,您
7、用什么方法证明酶活性中心的存在？纸上谈兵，请设计您的实验。,三、同工酶,催化的化学反应相同，而酶蛋白的分子结构、理化性质乃至免疫学性质不同的一组酶。,(一)同工酶(isoenzyme)概念,同工酶属于不同基因编码的多肽链，或由同一基因转录产生上的mRNA翻译的不同多肽链组成的蛋白质。,*乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH),乳酸脱氢酶的同工酶,乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+,LDH,生理及临床意义在代谢调节上起着重要的作用；解释发育过程阶段特有的代谢特征；同工酶谱的改变于 用对疾病的诊断；作为遗传标志，用于遗传分析研究。,心肌梗死和肝病病人血清LDH同工酶谱的
8、变化,酶的工作原理,第二节,The Mechanism of Enzyme-Catalyzed Reaction,能显著改变化学反应速度；在反应前后没有质和量的变化；只能催化热力学允许的化学反应；只加速可逆反应的进程，而不改变反应的平衡点。,酶与一般催化剂的共同点,（一）酶促反应具有极高的效率,一、酶反应的特点,催化效率比非催化反应高1081020倍，比一般催化剂高1071013倍。不需要较高的反应温度。加速反应的机理都是降低反应的活化能。,酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。,一种酶仅作用于一种或一类化合物，或一定的化学键，催化一定的化学反应并生成一定的产物。,酶的特异性(specifi
9、city),（二）酶促反应具有高度的特异性,酶对所作用底物的选择性。酶的专一性,根据酶对其底物结构选择的严格程度,作用立体异构体中的一种(光学、几何异构体),绝对特异性(absolute specificity),只能作用于一种特定结构的底物。,相对特异性(relative specificity)：,作用于一类底物(一类化合物或一种化学键),立体结构特异性(stereospecificity)：,（三）酶促反应的可调节性,对酶生成（诱导与阻遏）与降解量的调节酶催化效力的调节（别构调节和共价修饰）不同组织、亚细胞同工酶酶原激活,酶促反应受多种因素的调控：,（四）酶易失活,使蛋白质变性的因素都可
10、引起酶失活。,二、酶促反应的机理,降低化学反应的活化能,增加反应体系活化分子数,注入能量,酶比一般催化剂更有效地降低反应的活化能。,（一）降低反应的活化能,提高反应速度的途径,一定温度下，1mol底物分子从初态转变到活化态所需要的自由能。,活化能：,结论：催化剂降低反应活化能,蔗糖水解,酶底物复合物,（二）酶-底物复合物,有利于底物转变成过渡态,1.诱导契合理论,酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于底物结合的变化；底物在酶的诱导下也发生变形，处于不稳定的过渡态，底物过渡态与酶的活性中心互补。,酶与底物相互接近时，其结构相互诱导、相互变形和相互适应，进而相互结合。,2.酶促反应的高效性,邻近
11、效应与定向效应(proximity and orientation),酶和底物复合物形成既是专一性的识别过程，也是使底物分子间反应变为分子内反应的过程。,底物和底物(双分子反应)，酶的催化基团与底物之间结合于同一分子，使底物有效浓度得以极大提高而使反应大大增加的一种效应。,底物反应基团之间或酶的催化基团与底物的反应基团之间的正确取位产生的效应。,邻近效应：,定向效应,底物变形（distortion）,酶活性中心存在着广义的酸碱基团，能在近中性的pH范围内，作为催化性的质子供体或受体。,酶诱导底物分子内敏感键中某些基团的电子云密度发生变化，产生电子张力。底物更接近过渡态，降低反应活化能。,酸碱催
12、化（acid-base catalysis）,活性中心疏水环境中，较低的介电常数易于底物分子与催化基团的相互作用。活性中心中的微环境影响催化基团的解离。,共价催化（covalent catalysis）,酶活性中心亲核基团或亲电子基团，作用于底物的缺电子中心或负电中心，形成不稳定的共价中间复合物，降低反应活化能。,金属离子催化,活性中心微环境的影响,Kinetics of Enzyme-Catalyzed Reaction,第三节,酶促反应动力学,酶浓度、底物浓度、pH、温度、抑制剂、激活剂等。,研究一种因素影响时，其余各因素均恒定。,酶促反应动力学的概念,研究酶促反应速度以及影响酶促反应速度
13、各种因素的学科。,影响因素包括有,酶促反应速度,单位时间内底物减少量或产物生成量来表示，通常测定单位时间内产物的生成量。,P,t,酶促反应时间进程曲线,反应速度初速度，取底物的消耗量很小（一般在5以内）的反应速度。,S较低时，反应速度与底物浓度成正比；反应为一级反应。,Vmax,一、底物浓度对反应速度的影响,S增高，反应速度不再成正比例加速；为混合级反应。,S达一定程度，反应速度不再增加，达最大速度；为零级反应。,底物浓度对反应速度的影响呈矩形双曲线,（一）米曼氏方程式,中间产物,酶促反应模式中间产物学说,1903年，Henri根据蔗糖酶水解蔗糖实验,酶-底物复合物的形成(中间产物学说),E不
14、变时,米氏方程式(Michaelis equation),反应速度与底物浓度关系的数学方程式,E与S形成ES复合物的反应是快速平衡反应，而ES分解为E及P的反应为慢反应，反应速度取决于慢反应即 V=K3ES。(1),米氏方程式推导基于两个假设(稳态法),S的总浓度远远大于E的总浓度，因此在反应的初始阶段，S的浓度可认为不变 S=St,指ES的生成速度与分解速度相 等，即 ES恒定,K1(E-ES)S=K2 ES+K3 ES,稳态法(steady state)推导过程：,则(2)变为:(E-ES)S Km ES,整理：K1(E-ES)S=K2 ES+K3 ES,将(3)代入(1)：V=K3 ES
15、,Vmax=K3ES=K3E(5),将(5)代入(4)得米氏方程式：,在底物浓度远远大于酶浓度时，当酶的活性中心全部饱和时，即EES，反应达最大速度,当反应速度为最大反应速度一半时：,Km=S,底物的浓度,（二）Km与Vmax的意义,Km值,Km是酶的特性常数之一；当K2K3时，Km=K2/K1=Ks(ES解离常数)1/Km可近似表示酶对底物的亲和力；同一酶对于不同底物有不同的Km值。,Km意义：,Vm：酶完全被底物饱和时的反应速度,K3：酶的转换数(turnover number)，催化常数kcat,Vmax意义：,Vmax=K3 E,当酶被底物充分饱和时，单位时间内每个酶分子催化底物转变为
16、产物的分子数。,与酶浓度成正比。,用来比较每单位酶的催化能力。,双倒数作图法（Lineweaver-Burk作图法）,1/Vmax,-1/Km,（三）Km值与Vmax值的测定,Hanes作图法,在林贝氏方程基础上，两边同乘S,-Km,Km/Vm,二、酶浓度对反应速度的影响,酶没有被底物饱和的情况下，反应速度与酶浓度成正比。,V=K3 E,当SE,温度升高，酶促反应速度升高；温度升高，可引起酶的变性，反应速度降低。,三、温度对反应速度的影响,最适温度：酶促反应速度最快时的反应体系温度。,不是酶的特征常数,双重影响,四、pH对反应速度的影响,酶催化活性最大时的反应体系pH。,酶的最适pH不是酶的特
17、征常数,影响,活性中心必须基团酶分子构象辅助因子底物,最适pH,五、抑制剂对反应速度的影响,凡能使酶的催化活性下降，而不引起酶蛋白变性的物质。,凡能使酶蛋白变性而引起酶活力丧失的作用称为失活作用。,抑制剂对酶有一定选择性；引起变性的因素对酶没有选择性。,酶的抑制剂(inhibitor),酶的变性（inactivation）,区别,抑制作用的类型,不可逆性抑制(irreversible inhibition),可逆性抑制(reversible inhibition),竞争性抑制(competitive inhibition)非竞争性抑制(non-competitive inhibition)反竞
18、争性抑制(uncompetitive inhibition),专一性不可逆抑制非专一性不可逆抑制,(一)不可逆性抑制作用,不能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂使酶复活。,概念,抑制剂通常以共价键与酶活性中心的必需基团相结合，使酶失活。,特点,有机磷化合物,羟基酶,失活的酶,酸,有机磷化合物 胆碱酯酶的抑制,解毒：解磷定(PAM)与有机磷化合物形成稳定化合物。,机理：抑制胆碱酯酶的活性，造成乙酰胆碱堆 积，引起迷走神经兴奋性增高而中毒。,路易士气,失活的酶,巯基酶,失活的酶,酸,BAL,巯基酶,BAL与砷剂结合物,重金属离子(Hg2+,Ag+)及砷化合物巯基酶,解毒：二巯基丙醇(BAL),（二）
19、可逆性抑制作用,抑制剂以非共价键与酶或酶-底物复合物可逆性结合，使酶的活性降低或丧失；,竞争性抑制 非竞争性抑制 反竞争性抑制,类型：,概念：,抑制剂可用透析、超滤等方法除去。,特点：,竞争性抑制作用,抑制剂与底物的结构相似，与底物竞争酶的活性中心，从而阻碍酶底物复合物的形成，使酶的活性降低。,反应模式,竞争性抑制作用示意图,特点,抑制程度取决于抑制剂与酶对底物的相对亲和力及抑制剂与底物浓度的比例；,I与S结构类似；,Vmax不变，表观Km增大。,动力学特点：,丙二酸与琥珀酸竞争琥珀酸脱氢酶,磺胺类药物的抑菌机制,与对氨基苯甲酸竞争二氢叶酸合成酶,非竞争性抑制,反应模式,酶可以同时与底物和抑制
20、剂结合，两者没有竞争作用，但中间物EIS 不能分解为产物。,抑制剂是与酶活性中心以外的必须基团结合。,非竞争性抑制作用示意图,特点,抑制剂与酶活性中心外的必需基团结合，底物与抑制剂之间无竞争关系；,抑制程度取决于抑制剂的浓度；,Vmax降低，表观Km不变。,-1/Km,动力学特点：,反竞争性抑制,反应模式,酶只有在与底物结合后，才能与抑制剂结合。抑制剂与ES复合物结合，导致ES降低。,ESI,反竞争性抑制作用示意图,特点：,抑制剂只与酶底物复合物结合；,抑制程度取决与抑制剂的浓度及底物的浓度；,Vmax降低，表观Km降低。,动力学特点：,各种可逆性抑制作用的比较,六、激活剂对反应速度的影响,使
21、酶由无活性变为有活性或使酶活性增加的物质。,激活剂(activator),必需激活剂(essential activator)对酶的活性是必须的。,无机离子：K+、Na+、Mg2+、Fe2+、Cl-、Br-有机化合物：胆汁酸盐、Cys、GSH、EDTA,非必需激活剂(non-essential activator)激活剂不存在时，酶仍表现一定的活性。,酶 的 调 节,第 四 节,The Regulation of Enzyme,关键酶,调节方式,代谢途径的调节酶,调节对象,酶活性的调节（快速调节）酶含量的调节（缓慢调节）,1.变构调节(allosteric regulation),变构酶(al
22、losteric enzyme),一些代谢物与某些酶分子活性中心外的某部位可逆地结合，使酶构象改变，从而改变酶的催化活性。,（一）变构酶与变构调节,变构部位(allosteric site),一、酶活性的调节,2.变构效应剂(allosteric effector),变构激活剂：引起酶对底物的亲和力增加,变构抑制剂：引起酶对底物的亲和力减弱,3.变构酶的协同效应,当底物与一个亚基上的活性中心结合后，引起酶分子构象的改变，使其它亚基的活性中心与底物的结合能力发生改变。,正协同效应(positivecooperative effect),效应剂是底物本身，具有协同效应,负协同效应(negative
23、 cooperative effect),其v-S动力学曲线为S形曲线。,其v-S动力学曲线为类似双曲线。,例：6-磷酸果糖激酶-1(PFK-1)别构调节,别构激活剂：AMP;ADP;F-1,6-2P;F-2,6-2P,别构抑制剂：柠檬酸;ATP（高浓度）,（二）酶的化学修饰,在其他酶的作用下，酶蛋白肽链上的一些基团可与某种化学基团发生可逆的共价结合，从而改变酶活性的过程。,1.共价修饰的概念(covalent modification),是体内对代谢快速调节的方式之一。,磷酸化与脱磷酸化（最常见）乙酰化和脱乙酰化甲基化和脱甲基化腺苷化和脱腺苷化SH与SS互变,2.共价修饰常见类型,酶的磷酸化
24、与脱磷酸化,Mg 2+,（三）酶原与酶原的激活,有些酶在细胞内合成或初分泌时只是酶的无活性前体，此前体物质称为酶原。,一定条件下酶原向有活性酶转化的过程。,酶原(zymogen，proenzyme),酶原激活,实质是酶的活性中心形成或暴露的过程。,酶原激活的机理,酶 原,分子构象发生改变形成或暴露出酶的活性中心,一个或几个特定的肽键断裂，水解掉一个或几个短肽,酶原激活的特点,无活性酶原转变为酶的活性状态是不可逆。,某些蛋白水解酶原的激活过程,肠液中酶原的激活,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,胰蛋白酶原的激活过程,胰凝乳蛋白酶原(无活性),-胰凝乳蛋白酶(有活性),-胰凝乳蛋白酶(有活性),酶原激活的生理
25、意义,避免酶对细胞进行自身消化，并使酶在特定的部位和环境中发挥作用，保证体内代谢正常进行。有的酶原可以视为酶的储存形式。需要时酶原适时地转变成有活性的酶，发挥其催化作用。,二、酶含量的调节,诱导剂诱发酶蛋白生物合成的作用。诱导剂(inducer)：一般在转录水平上促进酶生物合成的化合物(底物、产物、激素、药物等)。,（一）酶蛋白合成的诱导和阻遏,辅阻遏物与阻遏蛋白结合后抑制转录的过程。辅阻遏物：在转录水平上减少酶生物合成的物质。,1.诱导作用(induction),2.阻遏作用(repression),酶的结构一旦发生改变，就易受蛋白水解酶的降解。,（二）酶降解的调控,溶酶体蛋白酶降解 非溶酶
26、体蛋白酶降解,酶在细胞内不断的自我更新,降解途径,酶的命名与分类,第五节,The Naming and Classification of Enzyme,1.氧化还原酶类(oxidoreductases)2.转移酶类(transferases)3.水解酶类(hydrolases)4.裂解酶类(lyases)5.异构酶类(isomerases)6.合成酶类(ligases,synthetases),编号,一、酶的国际系统分类及编号,分类,EC1.4.1.3,谷氨酸脱氢酶,二、酶的命名,习惯命名法,多数依据其底物命名：如淀粉酶、蛋白酶依据催化的反应性质：如水解酶、转氨酶结合底物和性质：如琥珀酸脱氢
27、酶在前面基础上，加上酶的来源或特点：如胃蛋白酶；碱性磷酸酶,系统命名法,每一种酶有一个系统名称和推荐名称,标明酶的底物及催化反应性质，若底物之一是水，可将水略去不写。,如谷丙转氨酶,丙氨酸:-酮戊二酸氨基转移酶,每个酶还有一个特定的编号。,酶与医学的关系,第六节,The Relation of Enzyme and Medicine,（一）酶与疾病的发生,一、酶与疾病的关系,有些疾病的发病机理直接或间接和酶的异常或酶活性受到抑制相关。许多疾病也可引起酶的异常，这种异常又使病情加重。激素代谢障碍或维生素缺乏可引起某些酶的异常。酶活性受到抑制多见于中毒性疾病。,（二）酶与疾病的诊断,1.酶活性测定
28、和酶活性单位,酶活性(enzyme activity,酶活力),酶催化化学反应的能力。大小或量值用在一定条件下催化某一化学反应的反应速率表示。,酶的活力单位（activity unit）,在一定条件下，一定时间内将一定量的底物转化为产物所需要的酶量。,在最适反应(温度25)条件下，每分钟催化1mol底物转化为产物所需的酶量为1个国际单位。,在最适反应条件下，每秒钟使mol底物转化为产物所需的酶量为1个催量。,1 kat=6010 6 IU 1 IU=16.6710-9 kat=16.67 n kat,国际单位(IU),催量单位(kat),kat与IU的换算：,2.血清酶对某些疾病的诊断,（三）
29、酶与疾病的治疗,许多药物可通过抑制生物体内的某些酶来达到治疗目的。通过阻断相应的酶活性，以达到遏制肿瘤生长的目的。酶还可以直接用于治疗目的。,二、酶在医学上的其他应用,（一）酶作为试剂用于临床检验和科学研究,酶偶联测定法(enzyme coupled assays)，是利用酶作为分析试剂，对一些酶的活性、底物浓度、激活剂、抑制剂等进行定量分析的一种方法。,1酶法分析,分光光度法(spectrophotometry),进行的酶偶联分析，测定己糖激酶活性,NAD(P)+和 NAD(P)H 的光吸收曲线,以酶作为标记物，通过测定酶的活性来判断被标记物质或与其定量结合的物质的存在和含量。如ELISA,
30、利用酶做为工具，在分子水平上对某些生物大分子进行定向的分割与连接。,2酶标记测定法,3工具酶,（二）酶工程（enzyme engineering）,1固定化酶(immobilized enzyme),将水溶性酶经物理或化学方法处理后，成为不溶于水但仍具有酶活性的一种酶的衍生物。固定化酶在催化反应中以固相状态作用于底物，并保持酶的活性。,2.抗体酶（abzyme）,3.模拟酶（artificial enzyme）,具有催化功能的抗体分子称为抗体酶。又叫催化抗体(catalytic antibody)。,模拟酶是根据酶的作用原理，利用有机化学合成方法，人工合成的具有底物结合部位和催化部位的非蛋白质有机化合物。,掌握酶的概念，了解酶学发展史。掌握酶分子结构与功能，酶的组成、分类，酶的必须基团和活性中心的概念。掌握酶促反应的特点，熟悉酶的催化作用机制。掌握酶促反应动力学的概念，底物浓度对酶促反应速度的影响、米氏方程及意义，了解其推导方法和过程。掌握影响酶促反应速度的各种因素，可逆性抑制酶的促动力学机制，特点，熟悉酶活性测定及酶活力单位。握酶活性调节的主要方式，酶原激活、共价修饰、酶的变构效应、同工酶的概念；熟悉酶含量调节。熟悉酶的分类，了解酶的命名。了解酶在疾病的发生、疾病诊断和治疗等应用。,总 结,
