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1、董文轩 授课教师：齐明芳 陈俊琴,现代园艺实验技术,本课程的主要目的 本课程的目的是使学生掌握园艺作物成分检测与分析方法的基础上，侧重培养学生对现代仪器分析方法的原理理解和具体应用能力。本课程的主要目标 通过学习现代实验技术在园艺作物上的应用理论基础，以及系统性综合实验的操作，提高学生的实验操作技能，同时在掌握方法的基础上，增强综合运用、实验设计及观察分析能力，提高学生的科研兴趣及解决实际问题的综合素质与能力。,本课程主要目的和目标,主要内容,一、园艺植物光合作用分析技术二、园艺植物与土壤中痕量元素的测定原子吸收分析法三、园艺植物与土壤中氮磷的测定连续流动分析法差异四、园艺植物芳香物质分析气相
2、色谱、质谱分析技术五、糖类（激素）分析技术液相色谱分析法六、蛋白质分离纯化柱层析分析技术七、蛋白质分离鉴定双向电泳分析技术八、园艺植物组织切片与显微观察技术,第一章 植物光合与荧光生理指标的测定,（一）园艺植物光合指标的测定（二）园艺植物荧光指标的测定,本章的主要内容,1、植物光合作用原理及常规测定方法2、LI-6400光合作用系统构成原理及测定内容3、LI-6400光合作用系统在测定过程中常见问题及解决方法实验一 使用LI-6400光合作用系统测定园艺作物光合生理指标实验二 使用LI-6400光合作用系统进行园艺作物光合CO2响应曲线的测定,1、植物光合荧光作用原理及常规测定方法2、LI-6
3、400荧光系统测定作物荧光指标的方法3、影响作物荧光的因素及测定中的注意事项实验三 使用LI-6400荧光系统测定作物光化学效率实验四 使用LI-6400荧光系统测定作物电子传递速率与光化学猝灭,绿色植物吸收阳光的能量，同化CO2 和H2O，制造有机物并释放氧的过程，称为光合作用。光合作用所产生的有机物质主要是糖类，贮藏着能量。CO2+H2O（CH2O）+O2 可见，测定公式中任一反应物的消耗速率或产物的生成速率（包括物质的交换和能量的贮藏）都可以用来计算净光合速率（Pn）。,一、光合作用测量的理论基础,净光合速率（Pn）的测定方法,（1）根据有机物的积累速率，主要有半叶法、植物生长分析法；（
4、2）根据CO2 及O2 体积的变化，主要有微量定积检压法；（3）根据O2 浓度的变化，主要有氧电极法；（4）根据CO2浓度的变化：酸度法、碱吸收法、14C 标记法、红外气体分析法、微气象法。目前，最常见的方法是红外气体分析法。,二、LI-6400光合作用测量系统,LI-6400是美国LI-COR公司的第三代气体交换测量系统主要特点：（1）开路式系统，保证了叶室内外环境条件的一致与同步变化，同时保证了被测量叶片的环境因子的稳定；（2）CO2/H2O 分析器位于传感器的头部，消除了气体交换测量的时滞；（3）可自动或手动控制叶室内部的环境条件（CO2浓度、光照强度、相对湿度、温度等），方便地进行环境
5、条件控制下光合速率的测定以及响应曲线的测定。（4）具有多个自动测量程序，如光响应曲线、CO2 响应曲线、光诱导曲线、光呼吸曲线、荧光CO2 响应曲线、荧光光响应曲线、荧光动力学曲线、荧光循环曲线等。（5）叶室小，结构简单，操作方便。,（一）硬件部分,控制器,电缆线,IRGA（红外分析器）或叶室,主机,外置光量子传感器,（二）实验室配置,叶室配置,荧光叶室,土壤叶室,标准叶室,附件,LED红蓝光源,CO2注入系统,1、LED红蓝光源,1）.可以提供02000mol m-2 s-1之间的任意光照强度2）.产热极少，基本不对测量叶片的环境条件产生影响。3）.LED红/蓝光源不仅提供红色光（影响光合作
6、用的最主要光照），也提供蓝色光（控制气孔开放的最主要光）。红色光的波长为665nm，蓝色光的波长为470nm。蓝色光是研究气孔动力学的关键。,2、CO2注入系统,1).CO2浓度是通过把精确控制的纯CO2注入到已过滤了CO2的空气中来得到的。2).可以确保高浓度CO2条件下的测量,生成完整的标准A-Ci曲线.3).在系统软件控制下,设定所需CO2浓度,或者使用AutoPrograms(自动程序模式)自动测量一系列不同浓度的数据.4).可以提供8小时高达2000 mol mol-1的CO2气体,（三）工作原理,LI-6400是气体交换测定系统。光合作用与蒸腾作用的测量是基于流经叶室的气流中CO2
7、和H2O差异。,开放式气路系统是以气泵为动力，空气流经同化室后排出，由于叶片光合气体中的CO2被部分吸收，用IRGA测量进入同化室和流出同化室的空气中CO2浓度差，并按下式计算出光合速率：Pn=FC/S 式中：Pn-光合速率；F-气体流量；C-同化室进气口与出气口CO2浓度差；S-叶片面积。,（四）LI-6400便携式光合作用仪功能,测量参数和计算参数,可计算光合作用指标,表观量子效率（AQY）：指200 mol.m-2.s-1低光强下光光合作用最初直线方程的斜率。羧化效率（CE）：又称叶肉导度，是在CO2浓度低于250 mol.m-2.s-1以下时测算出CO2 光合直线方程的斜率。气孔限制值
8、（Ls）：Ls1Ci/Ca 光呼吸速率：2O2、340mol.mol-1 CO2低氧气体下的呼吸速率。CO2利用率（CUE）：CUE（PnetTl RdarkTd）/（PgrossTl）Tl和Td分别为光期和暗期（以小时计）Pgross和Pnet分别为粗、净Pn Rdark代表暗呼吸速率,可进行的自动测量,光响应曲线：根据拟合曲线得出光饱和点、光补偿点、表观量子效率等参数。CO2 响应曲线：主要研究CO2饱和点、CO2补偿点和羧化效率 荧光CO2 响应曲线 荧光光响应曲线 荧光动力学曲线 荧光循环曲线等。,三、测量中的注意事项,植物的光合作用和其它的生命现象一样，也经常受着外因和内因的影响而不
9、断地发生变化。影响光合速率的外部因素有：光照、C02、温度、矿质元素、水分、氧、日变化等内部因素有种间差异、品种间差异、叶片性状、果实的存在等。因此时间的选择对测量的准确性至关重要。,测定时间的选择 选择晴天无云的上午9：3011：30测定较理想。除非设计测量阴天或夜间的光合情况，以及日变化测量。,注意：不同生育期一般测1-2次，天气情况要统一,2.选样 叶位要统一 代表性：选择最能代表叶色的植株 叶子的状态应选无病，完整，生 长健壮，向阳的功能叶片。包括处理的代表性，温室或露地不同栽培位置等的代表性。,3.触样 尽量不要触摸所测量的叶片，更不要触摸所测部位的叶表面。4.测定时夹样品 上样时要
10、叶面朝上轻铺到叶室中，叶片不能有折叠或褶皱。另一方面，叶片要夹在叶室的有效部分，即32cm的标准叶室内，防止叶室漏气而测量不准。,5.数据记录 当样品室CO2的浓度稳定时记录数据；也可观察CO2的值，稳定时记录数据。（通常一棵健康植株叶片的Gs值应在0.11.0之间。超出此范围，即不正确。）6.叶室位置 叶室要固定，与太阳光的位置要依据是否用自带光源而定。当用自然光时，叶室要垂直太阳光放置；若用仪器自带光源，叶室最好平放。因为这样，外界光量子传感器的位置与植物叶子在植株上长的一样，垂直向上，外界光量子参数也有用。,7.空气缓冲气瓶“Li-6400光合作用测定仪”是通过测量参比室和样品室的气体浓
11、度差异来测量光合速率和蒸腾速率的。外界空气中CO2浓度的自然波动(尤其是人为干扰比较大的情况下)必然造成参比室和样品室浓度的差异，需采用气体缓冲瓶来尽可能降低这一波动所造成的误差。一般空气缓冲气瓶应放在远离人群、远离交通的通风之处。如在室内或温室做实验需更大的缓冲，但不能采取把进气管放在室外而机器在室内进行实验。,8.LED光源 LED光源即红蓝光源，是“Li一6400光合作用测定仪”的配件之一。天气晴朗时可不用LED光源，直接利用自然光测定自然状态下的光合速率。LED光源虽能模拟一天的日变化，并迅速测完，但与自然条件下植物光合速率的日变化相差很远。如果测光补偿点或在阴天或多云的日子测定时，L
12、ED光源是不可缺少的。,9.环境控制 环境条件控制包括流量控制、CO2浓度控制、温度控制、光照控制等指标。一般情况下，流量控制意义不大，在外界自然条件下测量流量为500mols，温室中测定流量为300mols，并最好控制温度和光强等因子。光曲线的测定需要进行光照控制，CO2浓度控制对于 ACI曲线的研究非常重要。一般不做温度控制，除非进行温度曲线的测量。,使用中仪器常见问题,1、如果参考室浓度（CO2 R _ml值）显得稳定,而样本室浓度（CO2S_ml值）不稳定,这将提示传感器头某处漏气。如果两室都不稳定,则是主机漏气，应检查可能发生漏气的地方。2、进行光合作用时，样本室的CO2浓度（CO2
13、S_ml值）不变化，可能的原因：检查传感器头部的风扇是否在旋转？如是，请按照清洁光学通道的步骤清洁风扇。,3、传导（Ci）低或为负值 排除植物本身或所选测量叶片的生长状态不佳和外界环境（如，低温，或弱光）的因素外，一可能是在水分调零时间短，以湿空气调零。解决的办法是，水分调零应调的时间长些，百分位上的数波动时，才算稳定。二可能是干燥剂使用时间太长，需更换药品。,4、如果光合作用值太高,Ci将太低。其主要的起因:IRGA匹配不良。5、IRGAs Not Ready信息，电源（1）IRGA接头未插紧,电缆不好,IRGA电路板保险丝烧断。（2）IRGA不起作用 如果电源接到IRGA,但它仍不起作用,
14、可能是导光轮电机停转。（3）光照暗 样本室积垢太多,光学元件积尘,或者红外光源或探测器失效。,半叶法,植物进行光合作用形成有机物，而有机物的积累可使叶片单位面积的干物重增加，但是，叶片在光下积累光合产物的同时，还会通过输导组织将同化物运出，从而使测得的干重积累值偏低。为了消除这一偏差，必须将待测叶片的一半遮黑，测量相同时间内叶片被遮黑的一侧单位面积干重的减少值，作为同化物输出量（和呼吸消耗量）的估测值。这就是经典的“半叶法”测定光合速率的基本原理。测定时须选择对称性良好、厚薄均匀一致的两组叶片，一组叶片用于测量干重的初始值，另一组（半叶遮黑的）叶片用于测定干重的终了值，不但手续烦琐，而且误差较
15、大。,氧电极法,氧电极法是一种实验室常用的测氧技术。氧电极由嵌在绝缘棒上的铂和银所构成，以氯化钾为电解质，外覆聚乙烯薄膜，两极间加0.60.8v的极化电压，溶氧可透过薄膜在阴极上还原，同时在极间产生扩散电流。此电流与溶解氧浓度成正比，电极输出的记号，可在自动记录仪上记录下来。叶片在进行光合作用时如光合速率高，则放氧量多，溶解氧也多，叶片光合作用的放氧量，可以作为测定光合速率的指标。,红外气体分析法,由于 CO2对红外线有较强的吸收能力，CO2含量的微小变化即可灵敏地反映在检测仪上。红外气体分析法是根据光合过程中吸收 CO2的多少，直接计算出光合速率大小的一种测量方法，具有省时、省力、测量参数多等优点，更重要的是此法重复性好、数据稳定、准确，是目前最常用的一种方法。,
