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1、第七章 植物基因工程,一、植物基因工程的发展现状二、植物基因工程方法三、转化子细胞的筛选四、转化体的鉴定与证实五、植物基因工程研究的应用和展望,一、植物基因工程的发展现状,1、植物的遗传改良方法传统的育种方法 以基因突变体为种质基础，以有性杂交为基因导入手段，以选择优良基因型重组体为目的的植物性状的改良过程。植物基因工程以植物为受体的一种基因操作，即以分子生物学为理论基础，采用基因克隆、遗传转化，以及细胞、组织培养技术将外源基因转移并整合到受体植物的基因组中，并使其在后代植株中得以正确表达和稳定遗传，从而使受体获得新性状的技术体系。,2、植物基因工程的应用前景改变植物的遗传性状。获得抗病、抗虫
2、、抗除草剂等抗逆性状；改良农作物农艺性状，提高产品质量；改变植物的育性和不亲合性。作为一种生物反应器。药用蛋白和植物次生代谢产物的生产；生产某些有机化合物。植物基因功能研究。,3、植物基因工程研究成果 通过国家商品化生产或安全证书的有转基因耐贮藏番茄、转查尔酮合成酶基因矮牵牛、抗病毒甜椒、抗病毒番茄、抗病毒辣椒、抗虫棉花等6种我国自主研制的转基因植物。,转基因番茄 1994年，美国政府批准了他们研制成功抗干旱、早熟、保鲜的转基因番茄商品化之后，我国也相继成功培育出优良品种的转基因番茄，以满足人们的需求。,转基因甜椒 甜椒在栽培的过程中，容易受病毒的感染。我国科学工作者，采用转基因技术，培育出抗
3、病毒的甜椒。,转基因玉米 玉米是主要粮食之一，又可以提炼油脂，也可以用作食品和工业的原料以及作饲料，浑身是宝。人们称它是含金的植物。如今培育出转基因玉米，品质更好，产量更高。,我国科学工作者，用转基因技术，可以转变矮牵牛花的花色，使矮牵牛花的花色更加丰富多彩。,转基因牵牛花,转基因油菜 油菜是人们食用油的主要来源之一。一般油菜籽的含油量约为40左右。通过转基因技术，培育出来的油菜籽，可以大大地提高它的出油率。而且油的纯度质量更好,转基因小麦 从植物体中分离出合成赖氨酸的基因，把这基因转入小麦植株中，培育出转基因小麦。用这种转基因小麦制造出来的面粉，更适合用来烤面包，而且面粉中赖氨酸含量高，这种
4、面包的营养价值高。,二、植物基因转化的方法,原生质体介导法基因枪法根癌农杆菌介导法种质系统的基因转移（花粉管导入法）,1、原生质体介导法 以原生质体为受体，借助于特定的化学或物理手段将外源DNA直接导入植物细胞的方法。原生质体介导的基因转化是植物遗传转化研究中最早建立的一个转化系统。包括5种方法：聚乙二醇介导的基因转化脂质体介导基因转化电激法介导基因转化显微注射介导的基因转化激光微束介导的基因转化,PEG介导的基因转化 利用化学试剂，如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯醇(PVA)、多聚-L-鸟氨酸(pLO)和磷酸钙等，诱导原生质体摄取外源DNA分子，进入原生质体的外源DNA分子就有可能通过某种机制整
5、合到基因组中，完成遗传转化过程。第一例成功的转基因烟草就使用该转化方法获得的。,脂质体介导基因转化 利用脂类化学物质包裹外源DNA成球体，通过植物原生质体的吞噬或融合作用把包含外源DNA的脂质体转入受体细胞。特点：转化率高；操作繁琐；技术性更高。电激法介导基因转化 利用高压电脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道,从而促进外源DNA进入原生质体。特点：转化率高；操作简便；特别适于瞬时表达的研究；容易造成原生质体损伤。,显微注射介导的基因转化 利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体的细胞质或细胞核，从而实现外源基因的转移。特点：方法简单、转化率高；适用于各种植物和材料，无局限性
6、；对受体细胞无毒害。激光微束介导的基因转化 将激光引入光学显微镜聚焦成微米级的微束照射培养细胞，在细胞膜上形成能自我愈合的小孔，使加入细胞培养基里的外源DNA流入细胞，实现基因的转移。优点：操作简便；工作效率高；适应于各种动植物；受体的类型广泛；用于细胞器的基因转化。,2、基因枪法(particle gun)将外源DNA包被在微小的金粒或钨粒表面，然后在高压的作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，微粒上的外源DNA进入细胞后，整合到植物染色体上并得到表达，从而实现外源基因的转化。根据基因枪的动力系统，分为3种类型火药爆炸力为加速动力，采用塑料子弹和阻挡板。塑料子弹前端载放着DNA包裹的钨/金粉。
7、高压气体作为动力，如氦气、氢气、氮气等。把载有DNA的钨/金粉铺洒在一张微粒载片上，在压缩空气的冲击下，驱动载片，当载片受阻于金属筛网时，载有DNA的钨/金粉继续向下冲击射入细胞。高压放电为驱动力，可以无级调速，通过变化工作电压，使载有DNA的钨/金粉粒子能达到目的细胞层。,PDS-1000/He系统,基因枪的操作步骤DNA微弹的制备：金粉或钨粉50100mg、DNA、CaCl2、PEG4000和亚精胺靶外植体材料准备DNA微弹轰击轰击后外植体的培养转化率及其影响因素金属微粒的影响DNA沉淀辅助剂的影响DNA的纯度及浓度对转化率的影响微弹速度的影响植物材料的内在因素的影响,3、根癌农杆菌介导法
8、植物冠瘿瘤植物的一种癌症冠瘿瘤的起因：由根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)属根瘤菌科(Rhizobiaceat)对植物的侵染而引起冠瘿瘤的侵染过程：细菌通过伤口进入植物，在基因水平上转化植物。细菌DNA中的编码基因在植物细胞中表达，刺激植物细胞不受控制的分裂，形成瘤。,冠瘿瘤,Ti质粒(Tumor inducing plasmid)Ti质粒是根癌农杆菌染色体外的遗传物质，为双股共价闭合环状DNA分子，其分子量为95156 106D，约有200kb。Ti质粒的类型：根据冠瘿瘤合成的冠瘿碱种类不同分为：章鱼碱型(octopine)胭脂碱型(nopaline)农杆碱型(
9、agropine)Ti质粒的基因结构：T-DNA区、Vir区、Con区和Ori区共4个区段。,Ti质粒的遗传特性T-DNA区(transfer DNA region)Ti质粒中的一部分DNA片段，进入寄主细胞并插入基因组中，能够利用植物的酶系统进行转录和翻译，其表达产物可诱发植物产生肿瘤。T-DNA区结构特征：左右两端边界各有一个25bp长的正向重复序列(Lb和Rb)，具有高度保守性。右边界突变和缺失导致转移能力降低或丧失。T-DNA以单拷贝或多拷贝的形式随机整合到植物染色体DNA上。,胭脂碱T-DNA(23kb)pTiC58章鱼碱T-DNA(13.6kb)pTiAch5,NOS：胭脂碱合成酶
10、基因 ocs：章鱼碱合成酶基因；tmr：根性肿瘤基因tms：芽性肿瘤基因；tml：大肿瘤基因,Vir区(毒性区)在Ti质粒T-DNA区的上游的一组基因。表达产物激活T-DNA向植物细胞转移，使植物引发肿瘤。Con区含有农杆菌之间接合转移有关的基因(tra)Ori区(复制起始区)调控Ti质粒自我复制。,取代型Ti质粒克隆载体 用E.coli质粒克隆载体取代野生型Ti质粒的全部或部分T-DNA核苷酸序列，构建的载体。onc-Ti质粒克隆载体 T-DNA上Onc基因被取代；保留T-DNA的两端边界序列和nos基因。onc+Ti质粒克隆载体 T-DNA上的部分序列被pBR322所取代，仍保留Onc基因
11、。进入植物细胞后，可诱发冠瘿瘤，如pGV3850和pMPG1。,pGV3850从胭脂碱Ti质粒pTiC58衍生而来含有T-DNA边缘区，以及除T-DNA以外全部的DNA序列临近右侧边缘区(RB)编码胭脂碱合成酶的nos基因，供作鉴定转化细胞的记号缺失的T-DNA核心区由pBR322序列取代,35S启动子是植物基因工程中常用的组成型启动子,中间质粒克隆载体 T-DNA的部分序列插入大肠杆菌质粒克隆载体，承载外源基因后，须先在辅助质粒推动下进入农杆菌，再在农杆菌介导下送入植物细胞。共整合克隆载体系统利用体内重组技术构建大型无毒的Ti质粒重组体双元克隆载体系统 将带有外源目的基因的T-DNA和Vir
12、区，安置在不同的质粒载体上进行操作。特点：由两个彼此相容的Ti质粒组成 含有Vir区的质粒；含有T-DNA区段的DNA转移质粒,共整合克隆载体系统,双元Ti载体系统,根癌农杆菌Ti质粒介导的基因转化的分子机理农杆菌对受体的识别农杆菌附着到植物受体细胞诱导启动毒性区基因表达类似接合孔复合体的合成和装配T-DNA的加工和转运T-DNA的整合,三、转化子细胞的筛选,1、选择基因：一类编码可使抗生素或除草剂失活的蛋白酶基因。新霉素磷酸转移酶(neomycine PT,NPT)基因 含卡那霉素的选择培养基上，携带NPT基因的转化细胞存活；非转化细胞致死。强选择标记，应用广泛，但假阳性率高。潮霉素磷酸转移
13、酶(hygromycin PT,HPT)基因 在含潮霉素的选择培养基上，携带HPT基因的转化细胞具有抗潮霉素的能力，能够存活；非转化细胞致死。庆大霉素抗性基因(gentr)膦丝菌素乙酰转移酶基因(bar),2、报告基因：是指其编码产物能够被快速测定、常用于判断外源基因是否成功的导入受体细胞，是否启动表达的一类特殊用途的基因。_葡萄糖苷酸酶基因(gus)GUS是一种水解酶，能催化某些特殊反应进行，通过对反应产物的检测即可确定Gus基因的表达。荧光素酶(luciferase,LUC)基因 LUC是一种源于萤火虫的动物蛋白基因产物，能够催化生物发光反应。,四、转化体的鉴定与证实,PCR检测外源基因的
14、整合Southern杂交检测外源基因的整合RT-PCR检测外源基因的表达Northern杂交检测外源基因的表达Western杂交检测外源基因表达的产物,五、植物基因工程研究的应用和展望,1、抗逆基因工程-第一代植物基因工程抗虫基因工程：毒素蛋白基因、蛋白酶抑制剂基因、淀粉酶抑制剂基因、植物外源凝聚素类基因抗除草剂基因工程：修饰改造的除草剂作用靶蛋白基因；除草剂解毒基因。抗病基因工程：抗病基因、解毒酶类基因、抗菌肽及抗菌蛋白类基因、病程相关蛋白类基因、植保素类基因抗逆基因工程：逆境诱导的植物蛋白激酶基因、编码细胞渗透压调节物质的基因、超氧化物歧化酶基因、异黄酮途径相关酶基因、防止细胞蛋白质变性的基因、转录因子编码基因,2、植物品质改良基因工程蛋白质、碳水化合物和脂肪品质改良将编码广泛氨基酸组成或高含硫氨基酸的种子贮藏蛋白基因导入植物将某种蛋白质亚基基因导入植物将与淀粉合成有关的基因导入植物将与脂类合成有关的基因导入植物果品的后熟品质改良观赏园艺植物的品质改良,
