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1、第四章 植物细胞工程制药,植物细胞工程:以植物细胞为基本单位,应用细胞生物学,分子生物学等理论和技术，在离体条件下进行培养，繁殖或人为的精细操作，使细胞的某些生物学的特性按人们的意思发生改变,从而改良品种,制造新品种,加速繁育植物个体或获得有用物质的一门科学或技术.,高等植物次级代谢产物极其丰富多样，除药用之外，许多次级代谢产物还是食品、化工和农业化学的重要原料。,植物生长缓慢，受气候影响，即使是大规模的人工栽培仍然不能满足需要。,一方面通过化学合成的方法来生产，另一方面通过植物细胞培养方法来生产。目前成功培养的药用植物细胞：人参、长春花、紫草、甘草等。,内 容,第一节 基本概念第二节 植物细
2、胞的形态和生理特性第三节 植物细胞培养的基本技术第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素第五节 植物细胞培养的生物反应器第六节 进展与展望第七节 植物细胞制药实例,第一节 基本概念,1、植物细胞的全能性：植物体中任何一个具有完整细胞核的细胞，在一定条件下都可以重新再分化形成原来的个体。,全能性高低:受精卵胚胎干细胞生殖细胞体细胞植物细胞动物细胞,2、植物组织和器官培养：在无菌和人工控制条件下（培养基、光照、温度），研究植物的细胞、组织和器官以及控制其生长发育的技术。,进行植物组织培养，一般要经历以下五个阶段：1 外植体的选择及培养。2 诱导去分化阶段。3 继代增殖阶段。4 诱导分化生根成芽阶段。
3、5 移栽成活阶段。,植物组织培养的基本过程外植体 愈伤组织 胚状体已分化出根、芽,分化程度降低，分裂能力增强,重新分化出组织器官的过程（细胞分裂素、生长素）,细胞分化程度与细胞分裂能力呈负相关,3、外植体：是指用于植物组织细胞培养的器官或组织的切段，植物的各个部位如根、茎、叶、花、果等均可以作为外植体进行培养。植物的各个部分凡是能培养后成长成一颗植株的都是外植体。,4、愈伤组织：植物局部创伤后或者在组织培养中，当已经分化的细胞恢复了细胞分裂能力，而增殖形成的无组织，无器官分化的薄壁细胞团。在组织培养中，先由外植体增值产生，在一定条件下，对它进行一段时间培养。或者说是在植物受伤后或在植物组织培养
4、过程中形成的一种未分化的薄壁组织。,愈伤组织的形成,愈伤组织：离体的植物器官、组织或细胞，在培养一段时间以后，通过细胞分裂，形成一种排列疏松无规则、高度液泡化、无定形态的薄壁细胞组成的组织。,胡萝卜的愈伤组织,5、次级代谢和次级代谢物：它是相对于初级代谢物而言，一般指对生物体没有明确的生理功能，是生命的多余成分。次级代谢物多是生物药物。,理论与技术基础：植物细胞全能性、微生物液体深层发酵系统、遗传工程。,所有技术的建立都是基于一个基本的程序：首先在完整的植株求取所需的植物组织，进行植物外植体的培养，或诱导愈伤组织进行脱分化的培养，建立稳定高产的细胞株系，然后在此基础上进行原生质体培养、液体悬浮
5、培养或深层的大规模细胞培养。,植物组织培养,外植体,愈伤组织,新植株,蝴蝶兰试管苗工厂化生产,第二节 植物细胞的形态和生理特征,一、植物细胞的形态 为了适应其功能的需要，细胞形态各异，在活体内它是有各种各样的形状。,二、植物细胞的结构根据有无细胞核分成原核细胞和真核细胞。高等植物细胞均为真核细胞。细胞由细胞壁和原生质体组成，原生质体内有多种细胞器，发挥不同的功能。植物细胞有三个特点：具有刚性的细胞壁、大的液泡和质体。,细胞壁：具有一定硬度和弹性。对水溶液和许多生物活性物质具有通透性。,液泡：具有大的中央液泡是成熟的植物生活细胞的主要特征。液泡中有各种物质，蛋白酶，色素，晶体和多种代谢产物等，是
6、多种无机物和有机物的混合物，有的是细胞的储藏物（糖、有机酸、蛋白质、磷脂），有的是代谢物（色素、草酸钙等）。,质体：是一类与碳水化合物的合成与贮藏密切有关的细胞器。根据色素的不同分为叶绿体、有色体，白色体。其中叶绿体是光合作用的质体。所以说植物是光能自养型的生物。能源来源于光能，碳源来源于二氧化碳。,三、植物细胞的主要生理活性物质及其它化学组分,1、生理活性物质 对细胞内生化代谢和生理活动起调节作用。含量少，生理作用重要。酶、维生素、植物激素（代谢调节作用）抗生素和植物杀毒素：微生物产生的抑制某些微生物的物质是抗生素，对于高等植物来说，葱、辣椒、蒜、萝卜也能产生杀菌的物质，称为植物杀菌素。,2
7、、其他成分（后含物）分布在液泡内。是多种无机物和有机物的混合物，液泡中的这些后含物是植物药物的来源。植物细胞形成的次级代谢物大都送到液泡内堆积，因此如何取得液泡内的次级代谢产物是目前培养技术的关键。生物碱:麻黄碱、咖啡因、阿托品、喹宁等 糖苷类：黄酮苷、洋地黄毒苷、蒽醌、紫草宁 挥发油：薄荷油、丁香油、桉油 有机酸：苹果酸、柠檬酸、水杨酸、酒石酸,四、植物培养细胞的生理特征,1、植物细胞培养阶段包括延迟期，加速期、对数期、稳定期，植物培养细胞的重量的增加主要是取决于对数期，而次级代谢产物的累积主要在稳定期。由此产生了二阶段培养法，即先让植物细胞进行大量的生长，然后诱导形成大量的次级代谢产物。,
8、2、很少以单一细胞悬浮生长，而多以非均相集合体的细胞团形式存在。这种细胞团产生的原因有细胞分裂之后没有立即进行细胞分离细胞在对数生长后期开始分泌粘多糖和蛋白质，或者以其他方式形成粘性的细胞表面，从而形成细胞团，使得细胞培养液的粘度增加。并黏附于反应器。增加某些离子后可以使粘附性降低。,3、纤维素细胞壁形成细胞骨架相当脆弱，搅拌方式来进行生产时容易破坏细胞壁。搅拌主要是为了混合营养物质。4、所有的植物细胞都是好气性的，在培养过程中需不断的通入少量氧气（混合二氧化碳），以保持较低的溶氧水平，培养的pH值是5-7。,5、碳源供应上不同于植株，缺少光合作用不能合成碳水化合物，要供应有机碳源。实验室培养
9、可以使用光照培养箱。6、培养过程中形成泡沫，使细胞包埋在泡沫中，并从循环的营养液中出来。,第三节 植物细胞培养的基本技术,一、植物材料的准备 用于植物组织培养的外植体，必须是无杂菌材料。微生物在接触培养基时会大量繁殖，抑制培养物的生长，因此需灭菌处理。许多化学试剂均能作为表面灭菌剂使用，原则上应尽可能选择那些灭菌后易于除去或容易分解的试剂。,灭菌剂的选择和处理时间的长短取决于所用材料对试剂的敏感性。对灭菌剂敏感的外植体的灭菌时间不宜过长；而不敏感的，灭菌时间则可适当延长。经常使用的灭菌剂如下表。,常用灭菌剂的效果比较,二、培养基的及其组成,含有无机盐、碳源、有机氮源、植物生长激素、维生素等化学
10、成分。无机盐：包括各种大量元素和微量元素。氮、硫、钾、镁、钙等，它们是细胞的代谢所不可缺少的。碳源：植物细胞培养物通常为异养细胞，因此需要供应有机的碳源例如：肌醇，甘油、乳糖和半乳糖等化合物。,植物生长激素：植物代谢过程中形成的生长调节物质，能调节植物的生长发育，主要加入植物天然生长的五类生长激素（生长素、分裂素、赤霉素、脱落酸和乙烯）及其人工合成的类似生长激素。有机氮源：蛋白质水解产物或各种氨基酸。,维生素：植物属于自养生物，但本身合成维生素不足，主要加入B族维生素。其它对生长有用的未知复合物：常用的为植物的天然液汁，如椰乳、酵母提取物、西瓜水、苹果水、生梨汁等。它们的作用是提供一些必需的微
11、量营养成分、生理活性物质和生长激素物质等。,三、培养方法,1、按培养对象来说分为：原生质体培养和单倍体培养；2、按培养基类型可以分：固体培养和液体培养；3、按培养方式分为：悬浮培养和固定化细胞培养。,2、按培养基类型,固体培养和液体培养两种方法基本上是在微生物培养方法的基础上发展起来的。所谓固体培养实际上包括利用琼脂作为支撑物的固体培养和固定化细胞培养。如外植体和愈伤组织的培养。,液体培养：外植体诱导生成愈伤组织，经过较长时间的多次几代培养后，愈伤组织变疏松，经过震荡后分散为单细胞或小的细胞团，然后接种在液体培养基。但是在液体培养基中，细胞最终要以不均一的细胞团形式出现。,3、按培养方式,大规
12、模培养,成批培养法：培养基一次性加入反应器，接种、培养一定时间后收获细胞的操作方式。植物细胞培养过程中，次级代谢产物的大量累积往往发生在细胞生长的稳定期，基于此原理设计了植物细胞的两步培养法，即使用两个生物反应器，第一个反应器用于细胞生物量的累积，第二个反应器用于次级代谢产物的生产。,1983年，日本利用紫草细胞培养工业化生产紫草素，是世界上第一个利用植物细胞培养工业化生产次生代谢产物的例子。,半连续培养方法 在反应器中投料和接种培养一段时间后，将部分培养液和新鲜培养液进行交换的培养方法称为半连续培养法。每隔一定时间（如1-2d）收获部分培养物，再加人等量新鲜的培养基的方法。可以认为是一种具有
13、定时进出装置的成批培养系统。,连续培养方法：是培养若干天后连续收获细胞，同时不断补充培养液的方法。利用连续培养反应器，在投料和接种培养一段时间后，以一定的速度连续采集细胞和培养液，并以同样速度供给新鲜培养基以使细胞生长环境长期维持恒定的方法。,半连续培养方法和连续培养方法这两个系统较明显地提高了细胞的生产率，但由于收获的是快速生长的细胞，其中的次生代谢物含量依然很低。,两阶段培养法：控制不同的参数分阶段培养细胞。前阶段营养足，加大通气，促进细胞大量生长，后阶段由于营养短缺，溶解氧供应不足导致细胞代谢途径改变，转而累积较高含量的次生物质。即二阶段培养方法，可以使用两个生物反应罐，第一罐中投入生长
14、培养基，第二罐中投入生产培养基。,固定化培养法：细胞固定化是将细胞包埋在惰性支持物的内部或贴附在它的表面。惰性支持物包括网状多孔板、尼伦网套和中孔纤维膜等多种类型。可以将细胞固定于尼伦网套内，或固定于中空纤维反应器的膜表面。,固定化细胞的优点：易于控制培养条件，并易于获得次级代谢产物。固定化细胞系统比悬浮培养更适合于植物细胞团的培养；固定化细胞包埋于支持物内，可以消除或极大的减弱流质流动引起的切变力；,便于连续操作，流出部分培养物的时候，不会将植物细胞流出。固定化细胞反应器已经用于胡罗卜、长春花、毛地黄等植物细胞的培养。,第四节 影响植物次级代谢产物累积的因素,包括生物条件、物理条件和化学条件
15、，生物条件指了解生物的生理特点，物理条件是指培养的温度、光照、通气等，化学条件是培养基的要求。工业培养条件指对生物反应器的要求。,一、外植体选择,不同的植物外植体细胞培养物，其最大次级代谢产物的累积时间不同。次级代谢产物在不同的生长阶段累积，最大累积时间可以在植物生长发育的任何阶段。,二、培养条件的影响,1、培养环境的内在因素 接种和诱导：外植体的大小不仅影响所诱导的组织和细胞的生长，而且也关系到其次级代谢产物的生产能力。外植体的大小、细胞密度和营养成分与次级代谢的产率也密切相关。细胞株在进行继代培养后，因为转移的培养物的大小或密度不标准，也会影响细胞株次级代谢的产率。,基本培养基的组成：是愈
16、伤组织和细胞生长的基础。包括磷、氮、铜、碳源、植物生长调节剂、氧气、渗出物都会对次级代谢物的产率造成一定的影响。,2、二步培养法 细胞的生长和次级代谢物的积累在植物细胞的不同阶段，并且两个阶段需要的营养成分不同。第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基，第二步主要适用于次级代谢产物和合成的培养基，称为生产培养基。,2、二步培养法 前阶段营养足，加大通气，促进细胞大量生长，实现细胞的高生长率；后阶段的培养液提供低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖分或少的碳源，由于营养短缺，溶解氧供应不足导致细胞代谢途径改变。在培养上使用两个培养罐。,3、培养环境的外部因素 温度 搅拌频率 培养容器的影响 光的影响,
