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1、植物病害生物防治,福建省农业科学院作物所邱思鑫,病、虫、草对粮食生产的影响,农药控制,菜喜(Spinosad)、苏云金杆菌(B.t)、阿维菌素、井冈霉素、春雷霉素、农抗120、中生菌素,烟碱、苦参碱、印楝素、茶皂素、鱼藤酮、除虫菊酷,曼德拉毒素、斑蝥素、沙蚕毒素、性诱剂,农药的对农业生产的影响,保障农业生产上起到重要的作用农药的泛滥农药对人类健康及环境的影响 1.农药残毒的问题 2.破坏生态的平衡 3.污染土地与水域 4.造成害虫及病原的抗药性问题 5.土壤的劣化,蔬菜出口现状,2007年我国累计出口蔬菜（含鲜冷冻蔬菜、加工保藏蔬菜和干蔬菜，下同）736.66万吨，同比增长10.23%，出口额
2、55.78亿美元，同比增长13.49%。福建8.85亿美元。加入WTO，农产品国际贸易自由化的进一步发展，蔬菜业迅猛发展，但受国际贸易绿色技术壁垒的限制和制约，农药残留标准是贸易技术壁垒的主要内容。据统计，2004年，由于国外的绿色壁垒造成我国农产品的直接和间接损失估计就在100多亿美元，而安全问题引起的隐性损失难以估计。近年来，欧、日和东南亚等国家不但制定了更为严格的出口果品农药最低残留限量(MRLs)标准。,一、生物农药研究概况,虫害生物防治,是利用对植物无害或有益的微生物或其代谢产物影响或抑制病原物的生存和活动，压低病原物的数量，或诱导或增强植物抗病性，通过改变植物与病原物的相互关系，抑
3、制病害发生从而控制植物病害发生与发展的控病措施。,病害生物防治,病害微生物防治,科学记载从Sanfoid(1926)报道土壤中某些拮抗性微生物对于土传病原菌的抑制性开始的。Millard于1921年曾报道施用绿肥可以减轻美国马铃薯上发生一种放线菌(Streptomyces scabier)引起的疮痴病。Sanford证明是由于绿肥促使土中拮抗性放线菌增长所致，但未引起关注，不久青霉素问世（1928年，弗莱明），人们掀起寻找拮抗微生物的高潮，尤其是土镶腐生拮抗性放线菌发展较快，植病生防方面也开展了拮抗性放线菌的分离和应用研究，主要作为一种活菌剂用于土壤和种子处理以防治苗期病害，收到显著效果。PG
4、PR、Endophytic microorganism2007年Bacillus amyloliquenfaciens 全基因组测序,我国研究情况,我国植物生防的研究工作开始于上世纪50年代初期，曾经选出一批有效菌种用于生产实践。上世纪60年代开始，由拮抗性放线菌发展为利用一些快速生长繁殖的真菌、细菌以及病毒等;从腐生的土壤微生物到植物体微生态系中微生物的利用;病害种类从种传和土传病害到地上部的气传和虫传病害。上世纪70年代以来，病害生物防治的研究和实践十分活跃，而且发展迅速。上世纪80年代，浙江、山西、四川等地应用拮抗性木霉菌防治丝核菌和小菌核菌所致根病已有报道。上世纪90年代至今。,生物农
5、药产口,国内外已经有数十个相关产品登记,已开发成功的细菌生防制剂主要为：芽孢杆菌(Bacillus)假单孢杆菌(Pseudomonas)放射性土壤农杆菌(Agrobacterium radiobacter),EPA Registering products(December 16,2005),Agrobacterium radiobacter 2 Bacillus 32(B.subtilis 20;B.cereus 6)Pseudomonas 13Streptomyces 4Harpin 3Bacillus thuringiensis 123（Israelensis 29 Kurstaki 7
6、0）,我国登记,至今2006年8月在农业部登记的有效产品(不包括过期登记):枯草芽孢杆菌 5 地衣芽孢杆菌 1 蜡质芽孢杆菌 4单胞杆菌 3多粘类芽孢杆菌 1井蜡质 4 井枯草 2枯草假单胞 1,Products,Agrobacterium radiobacter:Galltrol,Nogall（K84）Bacillus spp.:BioYield,Companion,EcoGuard,HiStick N/T,Kodiak,Rhizo Plus,Serenade,Subtilex,YieldShield Pseudomonas spp.:BioJect Spot-Less,Bio-save,B
7、lightBan,Cedomon Burkholderia cepacia:Deny,Intercept,Blue Circle Streptomyces spp.:Actinovate*,Mycostop,Serenade,Serenade contains a unique,patented strain of Bacillus subtilis(QST 713 Strain)which provides over 30 different lipopeptides that work synergistically to destroy disease pathogens and pro
8、vide superior antimicrobial activity.Target Crop/Pathogen:powdery mildew,downy mildew,Cercospora leaf spot,early blight,late blight,brown rot,fire blight,and othersCrop:cucurbits,grapes,hops,vegetables,peanuts,pome fruits,stone fruits,and others,国内产品,我国商品制剂有亚宝、百抗、麦丰宁、纹曲宁青萎散、叶扶力、康地蕾得等。中国农业大学和云南农业大学共同
9、研制的微生物农药“百抗”获得农药部登记注册,已在多个省推广用,百抗是枯草芽孢杆菌B908,大田应用中对水稻纹枯病防效70%以上。南京农业大学生防菌B3(商品名麦丰宁)是由枯草芽孢杆菌B3菌株制成的活体生物杀菌剂,对小麦纹枯病田间防效达50%80%。华东理工的多粘类芽孢杆菌(康地蕾得)防治青枯。,选择性强，对人、畜安全，对环境影响极小活体生物防治对有害生物可以达到长期控制的目的，而且不易产生抗性问题生物防治的自然资源丰富，易于开发，生物防治成本相对较低生产设备通用性较好 产品改良的技术潜力大 开发一种生物农药约需投入200万400万美金，而开发一种新的化学农药，需要投资4000万8000万美元，
10、两者经费投入比约为1/20，两者的产品开发周期比约为1/21/3。,生物防治的优点,生物防治的作用效果较慢，在有害生物大发生后常无法控制生物防治受气候和地域生态环境的限制，防治效果不稳定目前可用于大批量生产使用的有益生物种类还太少，通过生物防治达到有效控制的有害生物数量有限生物防治通常只能将有害生物控制在一定的危害水平，对于要求高的有害生物，较难实施种群综合治理产品有效期短、质量稳定性较差,生物防治的局限性,二、生物农药研究对象的种类与应用,1微生物制剂 2 农用抗生素3 植物源杀菌剂4 抗病基因工程植物5 蛋白农药,细菌 真菌 放线菌 病原菌无致病力菌株的开发利用 病毒的弱毒株系利用,1 微
11、生物制剂-细菌,具有防病或诱导抗病作用。PGPR 主要是促进植物生长的根围细菌,分布于多个属内,主要有节杆菌属、固氮菌属、芽孢杆菌属、欧氏菌属、假单胞菌属和沙雷氏菌属等,研究较多的是芽孢杆菌和假单胞杆菌。内生细菌,芽孢杆菌(Bacillus spp),芽孢杆菌的许多菌株可有效抑制植物病害,又是自然界中广泛存在的非致病细菌,对人畜无害,不污染环境而备受各国研究工作者的青睐。很多优良的枯草芽孢杆菌菌株已经应用于生产实。防治Fusarium、Aspergill us、Alternaria 和Rhizoctonia 引起的番茄、豆类、麦类、棉花和花生根部病害防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃的叶面细菌和
12、真菌的病害,细菌,假单胞菌(Pseudomonas spp),常能在植物根围土壤中大量增殖,许多菌株对植物有抑制病害、促进生长的作用。可防治由腐霉(Pythium spp)和茄丝核菌(Rhizoctonia solania)引起的黄瓜和番茄的苗期猝倒病，以及小麦全蚀病(Gaeumanomyces graminis)、棉花幼苗猝倒病(Pythium ultimum)、马铃薯软腐病(Erwinia carotovora)等。,细菌,放射性土壤杆菌(Agrobactrium radiobacter),20 世纪70 年代澳大利亚首先应用K84 菌株来防治由Agrobacterium tumefaci
13、ens 引起的许多植物的根癌病。K84 的改良菌株K1026于1991年和1992年先后在澳大利亚和美国获准登记。,细菌,1 微生物制剂-真菌,目前已有20多个属的真菌被用于植物病害的生防实践木霉菌(Trichoderma)是植物病害生防制剂中开发产品最多的粘帚霉(Gliocladium)青霉菌(Penicillium)毛壳菌(Chaetomium)镰刀菌(Fusarium)、淡紫拟青霉(Paecilomyces)厚垣孢轮枝菌(Verticillum),木霉菌(Trichoderma),木霉菌(Trichoderma spp.)属于半知菌类的丝孢纲，丛梗孢目，丛梗孢科，广泛存在于土壤、根围、叶
14、围、种子和球茎等生态环境中。木霉菌是植物病害生防制剂中开发产品最多的早在1981年木霉制剂已在西欧一些国家商品化生产，包括哈茨木霉(T.harzinum)绿色木霉(T.viride)钩状木霉(T.hamatum)长枝木霉(T.longibrachiatum)康氏木霉(T.koningii)等种,真菌,多数用于植物土壤传播病害的防治，如Sclerotinia.Phytophthora，Rhizoctonia，Pythium，Fusarium，Verticillium，,酵母菌,酵母菌主要用于果蔬产后贮藏期病害的防治。灰霉病、青霉病、毛霉病,真菌,毛壳菌毛壳菌存在于土壤和有机肥中，如植物残体、草食
15、和杂食动物及鸟类的粪便中，能有效地降解纤维素和有机质。毛壳菌有300多个种，可预防立枯丝核菌、甘蓝格链孢属、拟茎点霉属、毛盘孢属、葡萄孢属,淡紫拟青霉菌、厚壁孢子轮枝菌及节从菌属真菌,真菌,番茄根结线虫刘杏忠等用淡紫拟青霉的培养料施入土壤对大豆孢囊线虫可持续23年的防效，造成大量的空孢囊。林茂松等用厚壁孢子轮枝菌防治南方根结线虫卵寄生率达90.8%。,1 微生物制剂-放线菌,放线菌中应用最多的是链霉菌及其变种，已有许多的成型制剂应用于生产上，如井岗霉素、内疗素、768、S-921、农抗120等，可用于防治黄瓜黑星病菌、辣椒疫病菌、棉花黄萎病菌、立枯丝核菌及番茄早疫病菌、灰霉病菌、甘蓝黑腐病菌和
16、白菜软腐病菌。放线菌是农用抗生素的主要来源之一。,1 微生物制剂-病原菌无致病力菌株的开发利用,不论真菌、细菌还是放线菌的病原菌通过自然突变或诱发突变都会产生一些无致病力的菌株，可用于生物防治。,2 农用抗生素,抗生素是生物包括微生物植物动物在其生命活动过程中所产生的次级代谢物，能在低微浓度下有选择的抑制或影响其他生物机能 防治植物白粉病的武夷霉素，防治多种真菌病害的农抗120多抗霉素，防治细菌病害的农霉素叶枯散中生霉素制黄杆菌素新植霉素利用抗生素基因组合合成创造已知抗生素糖苷的类似物或新的抗生素已成为产生新农抗的又一途径,3 植物源杀菌剂,植物是生物活性化合物的天然宝库，其中的大多数化学物质
17、如萜烯类生物碱类黄酮甾体酚类独特的氨基酸和多糖等均具有抗菌活性目前已经开始应用于生产防治植物病害的植物活性成分有大蒜素麻黄油细辛油银泰(银杏提取物的仿生制剂)、印楝等,微生物蛋白农药是对多种农作物具有很强生物活性的一类蛋白质药物。传统微生物蛋白农药：可以直接以胃毒方式杀死害虫。Bt杀虫晶体蛋白(ICP)，新型微生物蛋白农药：不直接杀灭害虫和病原物，而是激发植物自身的抗病防虫基因表达，促进植物生长。过敏蛋白(Harpin)、隐地蛋白(Cryptogein)激活蛋白(Activator)等。,4 蛋白质农药,新型微生物蛋白农药,植物病原细菌：梨火疫病菌、假单胞菌植物病原真菌：疫霉、腐酶、稻瘟菌 诱
18、导植物广谱抗性促进植物生长多功能蛋白激发子。微生物蛋白农药通过诱导植物本身的抗病基因表达而起到抗病防虫促进生长的作用,4.1 过敏蛋白Harpin,过敏蛋白是由欧氏杆菌产生的一种引起植物过敏反应的蛋白质，由300400个氨基酸组成，其分子量约为40kD，可诱导植物体内一系列基因的表达，诱导植物自身的生长系统和防卫系统，从而抵御多种病害的侵染和具有促生增产等功效。2001年美国Cornell大学和EDEN生物科技公司开发和成功研制出具有抗病防虫功能的广谱性微生物蛋白农药Messenger。该产品是2001年生物农药中最具代表性的新产品之一，也是当前国际上利用高新技术手段开发生物农药最成功的例子。
19、该产品在多种大田作物、经济作物上应用后，抗病增产效果十分显著，对多种病虫害防治效果达50%80%，增产效果10%20%。这类农药功能广泛，作用机制独特，对环境友好，荣获2001年度美国环境保护委员会颁发的总统绿色化学挑战奖。,4.1 过敏蛋白Harpin,南京农业大学王金生教授1997年以来将康壮素在国内40多种作物上安排了250多项田间试验，结果表明康壮素对约60种病害都具有不同程度的抗病作用。对辣椒病毒病诱抗效果达40.7%63.3%，最高达96.9%；对番茄叶霉病诱抗效果达70.1%；对草莓灰霉病诱抗效果达61.2%；对黄瓜白粉病诱抗效果达66.1%；对黄瓜霜霉病诱抗效果达56.4%；H
20、arpin超敏蛋白的活性易受氯气、强酸、强碱、强氧化剂、离子态药肥、强紫外线等的影响，使用时应加以注意，以确保其活性和效果。,4.2 Elicitin隐地蛋白,来源：Huet等将从隐地疫霉、樟疫霉和辣椒疫霉中纯化的分子量约10kD的多种蛋白类激发子命名为Elicitin(激发素);结构：Huet等发现的是一类特殊的外泌、小分子耐热蛋白，等电点为9.8，由98个氨基酸组成;功能：可诱导茄科的烟草和十字花科的油菜和萝卜产生过敏性坏死和诱导抗性等防御反应；抗病机理：Elicitin是通过水杨酸介导抗病信号途径，激发植物获得对真菌、细菌等病原物的系统抗性(SAR)，同时产生活性氧自由基、脂过氧化物、植
21、保素、PR蛋白等防御反应相关物质。,4.2 Elicitin活性蛋白,迄今已发现17种疫霉菌中存在Elicitin活性蛋白，根据等电点和对烟草的激活反应可分为-elicitin(酸性)-elicitin(碱性)，两种类型蛋白的氨基酸序列同源性达到60%以上。近年来从一些腐霉菌中也发现有Elicitin类活性蛋白存在，并能高效激发番茄的系统获得性抗性。,4.2Elicitin活性蛋白,国内也开展了Elicitin相关研究，研究热点集中在基因的克隆和表达上。谢丙炎等系统研究了苎麻疫霉诱抗激发蛋白的理化特性、功能及其基因结构，发现该蛋白对辣椒抗疫病有诱导抗性作用。用低浓度激发素处理茄科、十字花科等多
22、种非寄主植物可诱导产生过敏反应（HR），并使植物获得对病原物的系统抗病性。,4.3 激活蛋白Activate Protein,来源：激活蛋白是从交链孢菌、纹枯病菌、黄曲霉菌、葡萄孢菌、稻瘟菌、青霉菌、木霉菌、镰刀菌等多种真菌中筛选、分离、纯化出的一种新型蛋白。结构：氨基酸和核苷酸序列不同于过敏蛋白和隐地蛋白,根据其作用机理将此蛋白命名为真菌激活蛋白(Activator Protein)。该蛋白不诱导烟草植株的过敏反应，这与Harpin和Elicitin均对烟草植物产生过敏反应不同。功能：对植物烟草花叶病毒病、黄瓜花叶病毒病等多种病毒病和蚜虫的控制效果在75%以上，并能促生增产。激活蛋白处理种子
23、能够加快黄瓜种子的萌发，促进幼根的生长。还发现该蛋白制剂能够以特定的作用方式成倍地提高Bt对鳞翅目害虫的防治效果。作用机理：激活蛋白主要通过激活植物体内分子免疫系统，提高植物自身免疫力；通过激发植物体内的一系列代谢调控，促进植物根茎叶生长和叶绿素含量提高，从而达到提高作物产量的目的。,4.4 其他相关蛋白,2001年Veit等在瓜果腐霉细胞壁中分离到一种新的蛋白类激发子，能诱导双子叶植物产生多种防卫反应，但对单子叶植物无活性；该蛋白是许多微生物如细菌、卵菌、真菌等细胞壁的共有成分。糖蛋白(glycoproteins)：从植物病原微生物中己发现许多具有激发子活性的糖蛋白，主要包括:疫霉糖蛋白、酵
24、母糖蛋白、禾谷锈菌糖蛋白等。疫霉菌丝细胞壁及培养滤液存在一种分子量为42kDa的糖蛋白，对欧芹和番茄细胞具激发子活性。,4.4 其他相关蛋白,鞭毛蛋白(flagellin)：从植物病原细菌非亲和菌株中分离的鞭毛蛋白能诱导水稻悬浮细胞产生抗病防卫反应。无毒蛋白(avirulence protein)：病原菌无毒基因(avr gene)编码的产物可以作为激发子诱导含对应显性抗病基因(R gene)的寄主植物产生防卫反应。在番茄叶霉菌(Cladosporium fulvum)和寄主互作系统中己纯化了两种由病原菌无毒基因编码的小种专化性激发子，分别为28个氨基酸的AVR9蛋白和86个氨基酸的AV R4
25、蛋白。病菌只在和寄主互作时才分泌这两种蛋白，而在培养液中则不产生该蛋白。病毒蛋白：植物病毒的蛋白类激发子如病毒外壳蛋白，复制酶蛋白和运动蛋白等均能诱导植物产生HR。,4.5 蛋白质农药前景,微生物蛋白农药作用机理在性质上类似动物免疫的一种诱导抗性，对于多种作物具有诱导抗病虫和增产效果。随着具有此类生物活性的各种微生物被不断发现，对其活性功能基因的克隆鉴定、作用机理的深入研究，新型微生物蛋白农药的抗病促生作用将日益受到重视。蛋白农药具有自身无毒，不产生抗药性，在植物体内和土壤中易分解，无残留等优点。可大幅度提高农产品质量和国际竞争力，是农业健康生产技术体系中一种新型环保生物蛋白。,5 细菌群体感
26、应及其利用,群体感应(Quorum sensing)是细菌根据细胞密度变化进行基因表达调控的一种生理行为。具有群体感应的细菌能产生并释放一种被称为自体诱导物(autoinducer)的信号分子,它随着细胞密度增加而同步增加。当自体诱导物积累到一定浓度时会改变细菌特定基因的表达。,5 细菌群体感应及其利用,对于干扰植物病原菌QS系统,大致有以下3个途径:一是产生降解病原菌信号分子的酶,使病原菌QS系统不能启动它所调控的基因;二是产生病原菌信号分子的类似物与信号分子受体蛋白竞争性结合来阻断病原菌QS系统;三是植物可能利用QS系统中的信号分子来诱发植物的抗性。,三、植物病害微生物防治的机理,一、微生
27、物防治病害的机制,Wilson和Wisniewski(1989),一、微生物防治病害的机制,抗菌作用(antibiosis)溶菌作用(lysis)竞争作用(competition)重寄生作用(hyperparasitism)诱导作用(induction)交互（叉）保护作用(cross protection),抗菌作用(antibiosis),拮抗作用主要指两种或两种以上的微生物共同生长时,一种微生物在同化作用中产生某种或某几种特异的次生代谢产物(如抗菌素等抗菌物质),改变其微环境,从而抑制甚至杀死另一种微生物的现象枯草芽孢杆菌抗真菌肽:枯草菌素(subtilin),伊枯草菌素(iturins)
28、、杆菌肽(bacit racin)等,溶菌作用(lysis),几丁酶-1，3-葡聚糖酶等一系列胞外水解酶消解病原菌,竞争作用(competition),病原微生物通过植物上的自然孔口或(皮孔气孔等)，或是伤口侵入当组织有伤口时，拮抗菌和病菌孢子同时开始抢占营养丰富的伤口，相当短的时间内利用伤口营养大量繁殖，尽可能快的消耗掉伤口营养并占领全部空间，使得病原菌得不到合适的营养与空间条件，不能生栖繁衍，从而抑制病害的发生 空间位点竞争,即在植物根际、体表或体内及土壤中快速、大量繁衍和定殖,有效地排斥、阻止和干扰植物病原微生物在植物上的定殖与侵染,从而达到抑菌控病效果,重寄生作用(hyperparas
29、itism),诱导作用(Induction),产生与植物抗性蛋白合成基因表达相关的信号蛋白,诱导植物抗性,也可通过分泌相关蛋白如丝氨酸专性肽链内切酶直接诱导植物抗性。乙烯和真菌入侵都可以导致植物系统抗病性的提高,其中,由病原微生物的入侵所引起的称为系统获得性抗性(systemic acquired resistance);由非病原微生物的入侵所引起的称为系统诱导性抗性(induced systemic resistance)。,诱导作用(Induction),拮抗菌对寄主的诱导主要产生三方面的效果:1 抗病性次生代谢物的大量产生。如拮抗菌可以诱导橙类果实上蒿属香豆素scoparone)物质的积累。2 细胞组织结构的变化。诱导寄主细胞变形,产生乳突结构,抑制病原菌的入侵。3 抗性酶的产生。几丁酶、-1,3-葡聚糖酶和过氧化物酶等。,
