植物组织培养常规技术.ppt

《植物组织培养常规技术.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《植物组织培养常规技术.ppt（110页珍藏版）》请在三一办公上搜索。

1、第三章 植物组织培养常规技术,第一节 组织培养所需要的基本条件第二节 组织培养中的无菌技术第三节 培养基及其配制第四节 组织培养的基本程序第五节 外植体的褐变与玻璃化苗,第一节 组织培养所需要的基本条件,所需条件,实验室设置,仪器设备,无菌条件,一、实验室的设计与要求,实验室的设计和装备程度应依据工作目的、规模以及实际的经济状况而定。（一）化学实验室（二）无菌操作室（三）培养室（四）观察鉴定室（五）驯化移植室,（一）化学实验室,用途:化学实验室是进行预处理和前期准备的场所 器皿、用具的洗涤、干燥、灭菌和保存培养基配制植物材料的清洗和预处理存放各种器皿、设备和药品等需要的装备:化学实验室应有实验

2、台、药品柜、防尘橱或防尘柜冰箱、烘箱、天平、酸度计、水浴锅、电炉、灭菌锅、蒸馏水器等设备也可存放于该室的不同位置，相应的操作也在该室中进行。要求干净明亮，气流畅通。,（二）无菌操作室,用途：无菌操作室也称无菌室或接种室，它是组织培养中进行无菌操作的场所。设备：超净工作台、灭菌器等。要求：一般要求室内干爽、整洁、明亮，墙壁光滑平整不易积染灰尘，地面平坦无缝便于清洗和消毒。室内应尽量少放设备和器械，除在出入口安装移动滑门外，其他门窗均应密闭，以保证没有通风和空气对流，通风换气必须通过空气调节装置进行。定期用甲醛和高锰酸钾或其他药剂进行消毒灭菌，室内的上方和门口也应安装紫外灯，使室内保持良好的无菌或

3、少菌状态。无菌室外应设缓冲室,接种室,超净工作台,紫外灯,缓冲室,消毒药,消毒器,滑门,（三）培养室,用途：培养室是培养接种材料的场所。设备：摇床、光照培养箱、培养架、空调、加湿除湿设备、时间程控器械。要求：优越的照明条件：日光灯 良好的温控条件：自动控温电炉或空调等 能够保持一定的湿度：除湿机、加湿机（器）能进行通风换气。通风窗口或加装排风扇 环境条件的控制与要求,（四）观察鉴定室,用途:对培养物进行观察鉴定的场所。设备:显微观察设备:双筒实体显微镜、高倍显微镜、倒置显微镜及其相应的显微照相设备、离心机、测微尺和血球计数器等。组织切片染色设备:普通和超薄切片机、磨刀机、烤片台或烘片器、恒温箱

4、、染色缸等。照相冲洗设备等:照相机、近视镜、测光表、显影罐、放大机、暗袋或暗箱等。,离心机,（五）驯化移植室,用途：主要用于试管苗的驯化和移栽；也可用于母株的预栽培。设施：室内应备有弥雾装置、荫棚、移植床（苗床）、恒温恒湿控制仪、光照调节装置等设施以及培养土、培养盆（钵）、育苗盘等器材。驯化移植室1、2,二、常用仪器设备与器械,（一）常用仪器设备：超净工作台；高压蒸汽灭菌锅；冰箱；烘箱；天平；蒸馏水器；酸度计；摇床与转床；光照培养箱（二）常用器皿与器械 1培养器皿(图2)2盛装器皿 3计量器皿 4灭菌器械 5接种器械 6其他：漏斗、玻璃棒、落水架、器械支架、洗瓶、毛刷等。,三、环境条件的控制与

5、要求,光照温度 对大多数植物而言，252的培养温度是适宜的，低于15和高于35的温度对培养都不利。喜温性植物：在2628（如茄科、葫芦科、兰科、芸香科、禾本科、蔷薇科等）；冷凉性植物：1822或25较为适宜（如百合科、十字花科、鸢尾科、菊科等）。湿度：一般控制在60%80%之间。通气状况：,（一）光照,1光周期:一般采用周期性关照的方法。但对不同植物、不同培养物的特性、不同培养阶段所采取的措施不同。通常在愈伤组织诱导阶段，一般采用三种方法：全暗、周期性光照、散射性光照。多数植物适宜全暗或弱光下培养；而在器官分化阶段，则需要一定时间的光照。一般每天1016h的光照即可满足大多数培养的需要；2.光

6、照强度：一般光强在10003000lx；一般在培养的后期如生根阶段增强光照强度。3.光质：离体培养条件下，一般采用日光灯进行光照，光谱成分主要是蓝紫光，光谱的波长为419467nm。,第二节 组织培养中的无菌技术,一、控制污染的重要性二、污染类型 真菌污染与细菌污染（区别表）三、造成培养物污染的途径及防除措施 培养器皿；培养室环境；培养基本身；操作器械；植物材料；操作人员。接种室环境；,表4 细菌污染与真菌污染的主要区别,真菌污染2,（一）培养器皿的清洗和灭菌,2培养器皿的灭菌（1）高压蒸汽灭菌法。（2）干热灭菌法。烘箱中150（40分钟）或120（2小时）。,1培养器皿的清洗:,简单清洗去除

7、污物,泡于洗涤液,自来水刷洗,清水反复冲洗,蒸馏水漂洗,烘干或凉干,使用或暂存,（二）培养基的灭菌,1.高压蒸汽灭菌法A.装锅不可过满，要使锅内留有一定空间，便于热蒸汽的畅通。B.正式灭菌前将锅内冷空气排尽。C.要根据灭菌对象的性质严格把握灭菌时间和灭菌温度。2.过滤灭菌法A.适用于液体培养基B.培养基中易在高温高压下分解减效或失效的物质。(滤膜孔径为0.220.45m)。,培养基分装量与高压蒸汽灭菌所必须的最少时间*,120,121,122,排汽一定舒缓，以免造成培养基沸腾，沾染瓶塞引起污染。,负压过滤器,（三）植物材料消毒,1减少材料带菌的防范措施（1）取材前对母株的预处理：减少带菌机会，

8、改善生理状态。（2）对采来的离体材料进行清洗、刮除、冲洗等预处理。（3）确定最佳的取材时期。（4）内部已污染的材料弃之不用。2.材料表面灭菌（1）对灭菌剂的要求（2）常用灭菌剂种类（3）灭菌方法,常用表面灭菌剂的使用及其效果,灭菌效果好：彻底、安全、高效。对植物材料伤害小；灭菌剂易消除或易分解,对灭菌剂的要求,表面灭菌方法,灭菌剂的使用依据材料特性（植物种类、取材部位、大小、老嫩等）确定灭菌剂的种类、处理时间和处理浓度。做到既达到良好的灭菌效果又不损伤材料。一般多种药剂配合使用，交替浸泡、综合杀菌。对于表面具有蜡质层、绒毛的材料，灭菌时可加入少量浸润剂（如吐温-20）或辅以磁力搅拌、超声振动等

9、措施，以提高灭菌效果。灭菌剂要充分浸没材料。灭菌处理后，材料必须在无菌水中漂洗3-5次，以除去表面残留的灭菌剂。,经常打扫，保持清洁；接种室消毒：室内空气消毒：熏蒸灭菌法紫外灯照射灭菌喷雾降尘室内地面、墙壁、桌面等：用消毒液（2%的新洁尔或70%的酒精）擦拭灭菌。接种台消毒:紫外灯照射 70%-75%的酒精喷雾或擦拭台面。使用超净工作台:,（四）接种室环境灭菌,超净工作台,粗过滤器,高效过滤器,操作台面,使用超净工作台应注意的问题,超净工作台不应安装在尘埃太多的地方。在使用前应预热30-40分钟。操作前应先将实验材料和操作器械、药品等物品事先放入台内，不要中途拿进。台面上放置的东西不宜太多，特

10、别是注意不要把东西迎面堆的太高，以免挡住气流。定期检查，更换过滤器。,灭菌方法灼烧灭菌法：使用前插入70%或95%的酒精中浸一下，然后放酒精灯火焰上灼烧。应注意的问题灼烧应均匀充分；灼烧一次不宜使用过久，应多次反复灼烧；灼烧后冷却再用。采用灭菌器灭菌,（六）接种器械的灭菌,（五）培养室环境灭菌,（1）定期打扫，保持整洁；（2）地面、墙壁、培养架以及其他器材表面：用消毒剂进行擦洗或喷雾：酒精、来苏儿水、新洁尔灭。（3）空气灭菌：紫外灯照射；定期熏蒸灭菌（改用乙二醇）喷雾灭菌。（3）湿度不宜过大（60%-80%）。,（1）进入接种室前应洗净双手，穿好工作服，戴好工作帽和口罩。（2）接种操作前用75

11、%的酒精擦拭双手。（3）接种操作时要端座，不要俯身工作台，口鼻远离接种区（如瓶口），尽量不要讲话。（4）打开培养瓶口（拔棉塞时和盖棉塞时）前和盖盖之前，坚持灼烧培养瓶口和盖口（或棉塞），将微生物固定，防止进入瓶内。（5）接种过程中手臂切忌从培养基、无菌材料、接种器械等物品上方经过，以免引起污染。（6）当培养容器敞着口时，应倾斜瓶口防止污染物进入培养容器。,（七）操作人员的无菌操作,第三节 培养基及其配制,基本培养基与完全培养基培养基的作用一、培养基的组成及其作用（一）无机元素（二）有机营养（三）植物生长调节物质（四）附加物类（五）培养基的酸碱度和渗透压 二、培养基种类及其特点 三、培养基的配制

12、,基本培养基与完全培养基,维生素、氨基酸,糖、淀粉,椰乳、苹果汁、香蕉泥,植物激素,C、H、O、NS、P、B、I,抗生素,K+、Ca2+、Mn2+Mg2+、Zn2+,炭粉,基本培养基,完全培养基,根据植物所需浓度分为大量元素（0.5mmol/L）和微量元素（1）大量元素种类：C、H、O、N、S、P、K、Ca、Mg等。作用：N元素：组培中利用的无机氮主要有硝态氮(NO3-)和铵态氮(NH4+)两种形式.应注意：A.培养基中一般硝酸盐和铵盐按一定比例配合使用，两者比例大小应根据植物种类做适宜调整。B.培养基中硝酸盐和铵盐各自的含量过高或过低或比例不当，均不利于培养物的培养(一般硝酸盐25mmol/

13、L,铵盐8mmol/L)。,（一）无机元素,种类：主要包括Fe、Cu、Mn、Zn、Mo、Na、Co、B、I等。作用：微量元素在植物生命活动过程中，多以酶系中的辅基形式起着重要作用。使用中应注意的问题若使用量过大，常会引起植物细胞酶系失活、代谢障碍、蛋白质变性以及组织死亡等毒害现象。来源问题不同培养基配方中的用量差别很大 植物组织培养常用培养基中离子浓度的比较,（2）微量元素,植物组织培养常用培养基中离子浓度的比较,（二）有机营养,1.碳水化合物2.氨基酸3.维生素4.有机添加物几种培养基有机成分的比较,1.碳水化合物,作用：糖的加入主要是作为碳素来源和能量物质，同时糖具有维持和调节培养基渗透压

14、的作用。种类：蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、山梨醇、甘露醇等。应用：培养基中碳水化合物种类和浓度的选择主要依据培养材料而定，也视培养阶段而异。应用最广泛的糖类是蔗糖。通常使用浓度在2%-5%，在有些情况下使用较高的浓度，如花药培养和幼胚培养中。,2.氨基酸类,作用：为重要的有机氮源，对细胞的脱分化、再分化以及器官建成起重要作用，特别是胚胎发生中，多种氨基酸混合使用常起到良好的促进作用。种类:甘氨酸、丝氨酸、酪氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、水解酪蛋白（CH）和水解乳蛋白（LH）等也是常用的氨基酸类。应用甘氨酸、CH、LH最常用，前者的使用量较小一般再23mg/L，后两者一般为1001000 m

15、g/L。,3.维生素类,4天然有机添加物类,种类：多种多样，如椰乳、马铃薯汁、麦芽浸出物、酵母提取物等。应用有时必不可少，但使用要慎重。在定性研究中可行，但不能应用于定量化研究。,（三）植物生长调节物质,植物生长调节物质对于调节细胞分化、形态发生致关重要，是组培中的关键物质。种类：生长素类 细胞分裂素类 赤霉素类 乙烯 脱落酸,作用：主要作用是促进细胞伸长生长和细胞分裂,常被用于:诱导愈伤组织;根的分化;与一定量的细胞分裂素配合使用，可用于诱导不定芽的分化、侧芽的萌发与生长；胚状体的产生；种类：2，4二氯苯氧乙酸（2，4-D）吲哚乙酸（IAA）萘乙酸（NAA）吲哚丁酸（IBA）萘氧乙酸（NOA

16、）作用强弱：2，4-D NOA NAA IBA IAA,1.生长素类,应用情况：使用浓度范围为0.115mg/L，最常用的浓度为0.15mg/L。2,4-D：诱导细胞分裂的效果最强；趋向于抑制培养物的形态发生；诱导胚状体发生。NAA：应用最广泛，常与细胞分裂素配合使用，用于愈伤组织的诱导和器官分化。IBA：常用于生根。IAA：稳定性：2,4-D、NAA 性质稳定；IBA、IAA易变性。溶解：95%酒精或0.1mol/LNaoH,（1）作用：主要用于促进细胞分裂和芽的分化。主要用于：诱导芽的分化；解除顶端优势，促进侧芽生长与茎芽的增殖；延缓组织衰老，增强蛋白质的合成，显著改变其他激素作用。（2）

17、使用种类：玉米素（ZT）、6-苄基腺嘌呤（6-BA）激动素（KT）、2-异戊烯基腺嘌呤（2iP）（3）活性强弱ZT=2-iP 6-BAKT。,2.细胞分裂素类,（4）应用情况：使用浓度范围为0.110mg/L，常用的浓度为0.12mg/L。ZT：作用最强；价格昂贵。6-BA：应用最广泛。2iP：在某些木本植物（杜鹃）的茎芽分化中效果不错KT：可部分代替6-BA 的作用。（5）稳定性：6-BA和2-iP性质稳定；ZT、KT易变性。（6）溶解性：0.5或1mol/LNaoH或HCL,3.其他激素,（1）赤霉素类 常用的是GA3。GA3具有促进茎细胞伸长和打破休眠的作用，主要用于促进已分化茎芽的伸长

18、生长、刺激胚状体正常发育成小植株以及打破有些植物的种子、块茎、磷茎等的休眠。（2）脱落酸 ABA具有抑制蛋白质合成、诱导休眠、促进衰老和脱落的作用；也具有抵消和抑制生长素、细胞分裂素和赤霉素发挥作用的效应。（3）乙烯 乙烯含量的提高，将会引起培养物衰老、玻璃化、落叶甚至死亡等不良反应。,附加物类主要包括琼脂、活性炭、抗生素、抗氧化剂、生长抑制剂等。1.琼脂A.作用：B.用量：0.4%-1%，用量过大培养基变硬，从而影响营养物质的扩散和培养物对养分的吸收；用量不足培养基凝固不良，起不到支撑作用。2.活性炭 A.作用：吸附功能，除去培养基中的有毒物或培养物产生的有毒代谢产物；防止组织褐变、刺激胚胎

19、发生、利于培养物生根等功能。B.用量：0.2%-0.5%,（四）附加物类,3抗生素 作用：防止和控制菌类污染，减少培养材料的损失。种类：常用的抗生素有青霉素、链霉素、土霉素、庆大霉素等，用量一般在520mg/L。使用抗生素不能代替无菌操作。4抗氧化剂 作用:控制或缓解培养材料的褐变 种类:半胱氨酸、抗坏血酸、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、谷胱甘肽、二硫苏糖醇等。5生长抑制剂 作用:调节内源与外源植物激素的平衡，利于培养物的生长和分化 种类:根皮苷、三碘苯甲酸、矮壮素、比久（B9）、间苯三酚等,（五）培养基的酸碱度和渗透压,1.培养基的PH（1）调节PH的必要性（2）调节方法：酸度计或精密pH试纸，

20、配好的培养基常偏酸，偏碱的情况很少见。（3）调节依据培养基的pH因培养材料不同而异，大多数植物适宜的pH在5.66.0之间。pH的大小影响到培养基的固化程度。Ph6.0时，培养基将会变硬；6.2 失效柠檬酸铁PH6.0 失效,2培养基的渗透压,（1）意义：当培养材料和培养基之间处于等渗时，或培养材料的渗透压微低于培养基渗透压时，培养材料才可能从培养基中汲取养分。（2）培养基渗透压的调节 调节渗透压往往从调节糖浓度着手。渗透压的调节应根据培养材料、培养目的等的不同进行：对大多数植物而言，糖的使用浓度在2%5%的范围内是适宜的。如：幼胚、原生质体花粉培养：较高的渗透压 根的分化：较低的渗透压,二、

21、培养基种类及其特点,（一）培养基种类,三、培养基的配制,配制母液,量取母液并混合,称量琼脂、蔗糖，充分熔解琼脂。,定容,调PH,分装,密封与标记,灭菌,使用或暂存,第四节 组织培养的基本程序,选择品种、植株、取材部位,截取、切割外植体,外植体的灭菌与接种,组培苗的驯化与移栽,离体培养、根芽形成、植株再生,1.依据培养目的，选择性状优良、生长健壮、无病虫害的品种或植株。2.做好取材部位、取材季节、试材生理状态和发育年龄的选择。（1）取材部位A.培养目的；B.外植体（培养材料）应易获得，来源广，易培养。C.外植体经培养后是否会发生变异（变异的程度和优劣）对大多数植物而言：茎尖是较好的取材部位；叶片

22、是许多植物组培的起始材料；对一些培养较困难的植物，可通过其子叶或下胚轴来建立起组织培养再生体系。,一、培养材料的选择和预处理,（2）取材季节（3）外植体大小的选择 外植体的大小应根据植物材料和培养目的而定：枝段、茎段：包含腋芽，一般0.5-2cm 茎尖脱毒：0.2mm以下 叶片、鳞片等：0.5-2cm23.材料的处理（1）母株的预栽培：温室栽培、水培、暗培养等。（2）打破休眠：低温和赤霉素处理。（3）对材料的简单清理：去枯、去斑、清洗等。,试材的生理状态和发育年龄的影响,一般沿植物主轴，越向上部分所形成的器官的生长时间越短其生理年龄也相应越老，越接近发育上的成熟，越易形成花器官。,沿植物主轴越

23、向下，所形成的器官的生长时间越长其生理年龄也相应越幼，越易形成芽器官。,如烟草的表皮组培中，下部组织产生营养芽 的比例高，而上部产生花器官的比例大。,二、外植体的灭菌与接种,1.外植体的灭菌2.接种：经过灭菌的植物材料，按照不同的培养要求，经过剪切、分割处理后，移至培养基上（中）的全部操作过程，称为“接种”。注意：接种于固体培养基上的材料要求既要和培养基达到最大面积的接触，又要避免完全嵌入培养基。接种过程中应避免任何外界和操作不当引起的污染。单瓶内接多个材料时，应使之均匀分散开。,1.调整好培养室的温度、关照、湿度等培养条件。2.定期进行观察，根据变化做适宜调整。3.剔除遭污染的材料。,三、外

24、植体的培养,外植体,愈伤组织,芽或胚状体,生根或壮苗,芽或胚状体,完整试管苗,四、组培苗的驯化与移栽,（一）组培苗的特点 1根发育不良，无吸收功能或极低。2茎叶表面缺乏保护组织，气孔难以关闭并且开口过大，极易散失水分。3叶绿体发育不良，叶绿素含量低，叶片的光合作用很弱。（二）组培苗的驯化与移栽 1.原则 2.过程,驯化过程应遵循逐步过渡的原则。一般来说，在开始数天内，驯化条件应与离体培养时的环境条件相近，而在驯化后期，应逐步过渡到与自然栽培条件相仿。以实现：,异养,无菌,自养,高湿,低湿,恒温,变温,有菌,弱光,强光,过渡,离体培养条件,自然生长条件,组培苗的驯化移栽过程,1.获得根系良好的壮

25、苗（生根或壮苗阶段）。2.开瓶进行湿度和光照锻炼；让小苗直接接触外界环境，加强光照强度，降低湿度，使小苗由异养逐步过度到自养。一般锻炼一周左右。3.将经初步锻炼的小苗转移到苗床上。（1）移栽前应将小苗基部的培养基洗净，以免招致微生物侵染。（2）移栽后一定加强管理，注意保湿和遮荫。（3）培养初期可以适当浇灌营养液。4.将成活的小苗移栽到大田。,第五节 外植体的褐变与玻璃化苗,一、外植体的褐变（一）褐变的原因（二）影响褐变的因素（三）控制褐变的措施 二、玻璃化苗（一）玻璃化现象及其产生原因（二）克服玻璃化苗的防范措施,（一）褐变的原因,褐变的发生与外植体组织中所含的酚类化合物多少以及多酚氧化酶的活

26、性有直接关系。当外植体经受切割处理时，酚类化合物外溢并与多酚氧化酶接触，在多酚氧化酶的催化下酚类化合物迅速被氧化成褐色的醌类物质，醌类又会在酪氨酸酶等酶的作用下，与外植体组织中的蛋白质发生聚合，进一步引起其他酶系统失活，从而导致整个组织代谢紊乱，生长停滞，最终衰老死亡。,（二）影响褐变的因素,1植物材料（1）基因型（2）试材的生理状态（3）外植体的大小及其受伤害程度 2培养基（1）培养基的物理状态（2）培养基成分（3）培养基pH 3环境条件（1）光照（2）温度 4培养方式（1）转瓶周期（2）植板密度,（三）控制褐变的措施,1选择适宜的外植体和培养条件 选取具较强分生能力的外植体；筛选和调整培养

27、基组成（无机盐、植物激素等）确定适宜的光照、温度等环境条件。2使用抗氧化剂 如抗坏血酸（VC）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、血清白蛋白、柠檬酸、硫代硫酸钠、间苯三酚、炭粉等。3改变培养方式 采用液体培养或连续转移培养的方式。,（一）玻璃化现象及其产生原因,1.玻璃化现象形态上：叶、嫩稍呈水晶透明或半透明，水浸状；植株矮小肿胀，失绿，叶片皱缩成纵向卷曲；茎叶脆弱易碎。解剖结构上：茎尖分生组织相对较小，保持时期也短；细胞膨大，胞质稀，核变小，液泡化；细胞壁结构不完整；叶表缺少角质层蜡质或蜡质发育不完全；没有功能性气孔；叶片不具有栅栏组织，仅有海绵组织；输导组织虽存在，但导管和管胞木质化不完全。生理生

28、化特点：苗含水量很高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和木质素等成分的含量低；吸收和光合作用的能力降低，分化能力也下降，生根困难，很难实现移栽成活。,2.产生玻璃化苗的原因,(1)植物材料(2)培养基 激素种类与浓度 一般激素浓度的增加尤其是细胞分裂素用量的提高（或细胞分裂素与生长素比例高），易导致玻璃化苗的产生。琼脂用量与糖浓度 适当增加琼脂用量或提高糖浓度有助于减少玻璃化苗的发生。,（二）克服玻璃化苗的防范措施,1适当提高培养基中的蔗糖浓度和琼脂用量。2改善培养容器的气体交换状况。3控制培养温度，增强光照 4改进培养基的组成 适当降低培养基中的细胞分裂素浓度，提高生长素比例；或适当增加培养基中钙、镁、锰、钾、磷、铁、铜、锌的含量，降低氮和氯元素的比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮含量，可减少玻璃化苗的发生。5在培养基中添加其他物质 如间苯三酚、聚乙烯醇、多效唑、矮壮素、活性炭等附加物。,香石竹玻璃化苗,