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1、异常色谱行为与衬管的关系,江西省日博工贸有限公司2006年11月,1拖尾峰：,可能原因：是柱和进样衬管吸附样品组分或污染镀金进样口密封垫；注射器针头撞击进样衬管内填充物破碎；柱末端切口不整齐（会使样品产生吸附）；衬管断裂。排除方法：换新的去活衬管；拆下色谱柱，清除污染物，用性能可靠的毛细管熔融石英切割工具将柱切成齐口，然后重新安装色谱柱；调节进样口总流量在40ml/min以上。,2.前伸峰（leading peaks）,可能原因：样品分解。排除方法：用新的去活衬管。,3.出峰后基线上升,可能原因：样品分解。排除方法：用新的去活衬管。,4.大峰后基线变化,可能原因：色谱柱末端和衬管不在同一轴线上
2、。排除方法：检查末端和进样口衬管安装，必要时调整它，使柱入口端和衬管在同轴上。,5.未分离峰,可能原因：色谱柱或进样衬管污染或柱效变坏。排除方法：用新的去活衬管。,液相色谱系统的故障有多少与溶剂和样品的过滤有关,1过滤膜的类型,聚四氟乙烯膜（一般用于有机相）几乎可以和所以的溶剂、酸和碱相容。尼龙66膜（一般用于有机相）可以和大多数溶剂、有机物和水相容，建议不要用于强酸、二氯甲烷和DMF。纤维素硝酸酯(一般用于水相)主要用于过滤器,可以和多数水性和非水性溶剂相溶,但不是所有的水性和非水性溶剂.再生纤维素膜一般用于HPLC生物样品和有机溶剂的制备和过滤,是通用型HPLC过滤器,具有广泛的溶剂相溶性
3、,与蛋白质键合作用低,非常低的可萃取性.,2、在样品溶液中有颗粒存在会造成故障时要用膜进行过滤.,3.流动相,溶剂的污染,特别是水相缓冲溶液的污染是HPLC中常见的问题,水相介质是微生物生长的良好环境,而微生物可以堵塞HPLC系统,并造成背景噪音.,4.溶剂入口过滤头,未经过滤的溶剂或溶剂瓶中生长的微生物都会降低溶剂入口过滤头的寿命,并影响泵性能.一般3个月清洗或更换.,5.测试溶剂入口过滤头是否堵塞,将溶剂入口管从过滤头和瓶盖组件处拨下,如果管线中充满溶剂,当过滤头性能良好时,溶剂会自由地从管中滴出如果堵塞，就没有溶剂或只有很少量的溶剂从管中滴出,6、不要使用超声清洗溶剂入口过滤头，否则玻璃
4、颗粒可能是破碎造成堵塞,气相色谱毛细管柱安装,江西日博工贸有限公司2006年11月,熔融硅毛细管柱组成：,琥珀褐色（或淡黄色）聚酰亚胺（CO（CH2）34CON=CH（CH2）5NHn）涂渍在管外壁保护管防止其破裂；熔融硅空心管；均匀涂布在管内壁的固定相（常用的有聚硅氧烷Si(CH3)3 OSi(CH3)3O n Si(CH3)3、聚乙二醇、HO（CH2 CH2O）nH、固体吸附剂多孔层开管PLOT（Al2O3、分子筛、苯乙烯基苯、二乙烯基苯-乙二醇二甲基丙烯酸酯）。,柱安装工具：,柱切割工具如钻石、陶瓷片、宝石铅笔刀；适当的不保留化合物；柱测试物；电子流量计；电子检漏计（后三种为可选件）。,
5、安装步骤1：,检查净化管、载气、隔垫、衬管：必要时更换净化管；在进样口换新隔垫：必要时换衬管及镀金平板（特别是进了大量脏样品和分析活性高化合物后）。柱的固定液室温下容易被氧化损坏，可以使用充载气保存延长使用寿命和减少噪音，推荐使用带有指示色的高容量的脱氧管，带有指示色的脱水管应安装在脱氧管前。,安装步骤2：,套上柱螺母和密封垫、切割柱：在柱两端安装柱螺母和密封垫，将柱固定在柱箱中，铭牌朝外。切去柱两端约5cm，切割方法：戴不起毛手套，手指将柱固定，用切割工具在适当位置划一切口，不能来回切割，也不要用切割工具完全切断。两手相向掰去柱切割部分，用放大镜检查切口，应边缘平整、无毛刺等。否则重新切割。
6、,安装步骤3：,进样口、检测器处柱的安装：柱安装在柱箱中，边缘不要与柱箱接触；展开柱使之成圆滑的弧形，避免在紧固时使柱断裂；依据进样口类型和检测器要求确定柱露出长度；用手旋紧柱螺母，再用扳手旋紧，但不要超过1/4圈；装好后不要再旋动柱；密封垫在加热后会结合更紧密。,安装步骤4：,开载气：调整柱头压获得合适的载气流量，下表是推荐值，实际使用的可根据载气线速度确定。将柱出口端浸入正已烷，可见气泡，否则，检查载气，流量阀，检漏，装柱前挥去残留溶剂。载气种类选择：对毛细柱首选的载气为高纯氦和氢气，不推荐使用氮气。对极小口径的如0.1mm内径的毛细柱使用氢气。载气纯度至少99.995%并且氧含量低于1p
7、pm。但应注意氢气混合在空气中浓度在4%-10%时容易发生爆炸。,安装步骤5：,检测器端柱安装：按步骤2和3进行安装，用流量计测定柱载气流量。,安装步骤6：,检漏：GC系统在加热前要检漏，电子检漏计是最可靠的和最合适的，不要使用皂沫。可以适当使用异丙醇与水（5+5）的混合液。,安装步骤7：,确定载气流量和正确的柱安装：有EPC电子流量控制的可以直接设定载气速度或流量，但应输入正确的柱内径，可以通过附在柱盒内的柱效能测定结果表获得：适当的载气流量在步骤4获得，也可通过不保留化合物进行测定计算获得。,下表是不同检测器的一些不保留化合物。,注：以上化合物在PLOT柱上大多数都有保留；不要进液体，使用
8、非常低的顶空气进样；柱温低于100乙腈在多数柱上都有保留，必须设定柱温在100以上。,测定步骤：,设定柱温35-40，在分流模式下快速进样1-2ul上述推荐的不保留化合物；在使用大体积进样或冷柱头进样模式时，应将其稀释以免使检测器饱和。观察到的应是尖锐的对称峰；不分流进样时会又拖尾现象，若没有峰，则检查载气，流量控制系统，检测器，记录仪，进样针等。峰拖尾严重，则可能是进样口漏，柱安装不好，分流比太小。,安装步骤8：柱老化：,通载气15min后升温至低于柱最高使用温度10-20，但必须高于操作温度，绝对不能超过柱最高使用温度。到达设定温度后观察基线，在5-30min基线上升，30-90min后下
9、降，在老化温度下1-3小时后基线平直，若2-3小时后基线仍不稳定则停止老化。产生原因可能由载气管路，进样区泄露或系统受污染引起。检查各部分再进行老化。产生原因可能由载气管路，进样区泄露或系统受污染引起。检查各部分再进行老化。极性固定相和液膜较薄的老化时间要比非极性和厚液膜的长，而PLOT柱老化有其特殊性，可参考购买说明书。对ECD，MSD等检测器老化时不能连接检测器进行，但在老化后必须切去10-20cm后才能连接检测器。,安装步骤9：载气线速度精确设定：,对毛细柱，载气线速度直接影响保留时间和柱效。没有EPC控制的GC：温度的改变载气线速度也改变，在设定线速度时首先应确定分析时所需温度（常使用
10、柱起始温度），在步骤7中选定相应物质进样1-2ul并按下式进行计算得到线速度，调整柱头压直至得到所需的线速度。u（平均线速度）=L（柱长）/tr(保留时间)。推荐的平均线速度：氦气（30-40cm/sec）,氢气（50-80 cm/sec）。有EPC的控制GC：可以通过计算机工作站或GC键盘直接设定并能维持恒定。需要做的是进行柱尺寸的校正，柱内径可从柱信息表上获得，而长度需要进一步校正。,安装步骤10：柱流测试：,对老化后的柱进行空运行（不进样）获得色谱图，起始温度40-50，以10-20/min的升温速率升至老化温度并维持10-15min。在谱图上应该不出现任何峰。有峰出现表明受到污染，最常
11、见的进样口部分。,安装步骤11：运行测试样：,进样测试样品进一步了解系统性能，对不同检测器有相应的测试样品。测试样品一般在不同柱上都有响应并且常常是混合物。对新柱而言色谱图不好则表明安装，操作或仪器出了问题。在样品分析前必须解决。,柱使用时应注意的几点:,为最大限度延长柱寿命,在分析完柱温应在100以下待命;用隔垫封好柱两端保存在柱盒中,下次使用时切去一小段防止进入柱中的隔垫碎些影响测定;化学物质的相容性,对键合的或交链的固定相能防水和有机溶剂,无机酸(HCL、H2SO4、H3PO4、HNO3等）和碱（KOH、NaOH）会极大损害柱，一旦发生可截去1m;柱的冲洗,非键合相的柱不能用溶剂冲洗,如
12、DX-1,DX-2,DX-4,SE-30,SE-52,SE-54,Carbowax,ov-351,Cyclodex-B,Cyclosil-B,HP-20,HP-101,HP-17,HP-Chiral;限制温度,柱给出的有最低和最高使用温度，最高使用温度有两种，恒温使用的温度低，可长时间使用，在程序升温使用的温度下一般不要超过10min.,怎样正确选择分流/不分流进样,当感兴趣的组分在500ppm左右或更高时，最好选择分流进样；而不分流进样则是GC进行痕量分析的有效进样方式。,要得到长期一致的结果，需要正确选择隔垫、衬管和密封垫圈，并且要知道何时更换。,隔垫的寿命取决于进样的频率、针的质量和隔垫
13、的成分，隔垫漏气的征兆包括保留时间增长或漂移、响应值减弱、柱头压力减少并伴随着检测器信号噪音加大。,隔垫被污染的征兆是和样品、溶剂、进样隔垫或色谱柱无关的外来峰出现。,在衬管上的活化点会吸附样品，会造成拖尾并会大大降低灵敏度和再现性，在使用不分流进样或在分析稍有极性的化合物时一定要用脱活的衬管。但即使使用经过脱活的衬管在开始时也可能出现活性，此时就要清洗衬管或更换。,密封垫圈一般都在高温和惰性气流里进行了老化处理，使用时其收缩作用达到密封。,隔垫类型,1、流失和温度优化隔垫：可减少粒化，低流失和高温分析时性能最佳，用于进样口温度高达400，分析重烃混合物，通常在50100次进样之后更换。2、绿
14、色隔垫：减少粒化，用于进样口温度低于350，分析半挥发混合物，通常在500100次进样之后更换3、通用红色隔垫：低流失和长寿命的经济实用型，用于进样口温度低于350，分析半挥发混合物，通常在100次进样之后或出现漏气时更换。4、Merlin Microseal隔垫：超长寿命隔垫无颗粒，用于中等色谱温度下的高通量、常规分析，通常在2000次进样之后或出现漏气时更换。,密封垫类型,1、镀金密封垫：比不锈钢密封垫惰性更强，适合大多数不分流进样器的流量，用于不分流进样，或总流量低于200ml/min的分流进样，在分析物信号降低或出现明显拖尾时更换。镀金密封垫，十字孔：比不锈钢密封垫惰性更强，适合大多数
15、不分流进样器的流量，用于分流进样，总流量大于200ml/min的分流进样，在分析物信号降低或出现明显拖尾时更换。,衬管类型,1、分流：玻璃毛和锥形底部，提高了进样精度，用于分流进样，特别是使用电子压力控制（EPC）的进样口，在分析物精度降低或衬管污染时更换。2、单锥形不分流：去活化，将流量集中在柱子上，用于大部分不分流进样，在分析物影响显著降低或明显拖尾时更换。3、单锥形，玻璃毛不分流：去活化，将流量集中在柱子上，玻璃毛能减少不挥发残渣的影响，用于分析脏的样品，但玻璃毛可能使活性样品出现问题，在分析物拖尾严重时更换。双锥形，去活化不分流：去活化，将流量集中在柱子上，有助于防止反冲，用于高度挥发
16、的溶剂（进样器温度250以上，水、甲醛、二氯甲烷），或高温下大体积进样，在分析物响应显著降低或明显拖尾时更换。,FID喷口的清洗,通常更换喷口比清洗喷口更方便，尤其是对严重污染的喷口。在清洗时千万不要刮伤喷口内避，否则不能再使用。清洗需要准备的用品包括超声波清洗浴、洗涤剂水溶液、GC级甲醇、干燥空气或氮气、钳子或镊子。,步骤如下：用一根干净的金属丝从喷口顶端插入，穿过底部来回穿通几次，一直到可以光滑地拉动为止，注意不要刮伤喷嘴；往超声波清洗浴中加入洗涤剂水溶液，把喷嘴放到清洗浴中，超声5min；用一个喷嘴钻空器清理 喷嘴内部，再超声5min；以下必须使用镊子进行操作，从清洗浴中拿出喷嘴，先用热
17、的清水洗涤，然后用少量甲醛洗涤；用热的压缩空气或氮气吹干喷嘴，把它放在纸巾上，晾干。,典型的GC/MS症状,1、症状,灵敏度低：GC条件不适合、分流比不适当；背景高；隔垫、柱残留；EM需更换；真空不够；调谐不理想污染严重：样品净化不够；载气不纯；GC系统污染；MS系统污染真空度低：空气泄漏；柱流量过大；泵故障效率低,2、现象及可能原因,质量轴不正确：MSD没有足够时间平衡；实验室温度变化较大；MSD长时间未调谐；不正确的调谐文件前驱峰很大：推斥极电压过高；峰过宽；四极质量滤器极性不对；四极杆脏,3、M/Z502的相对丰度低于2%,不同调谐程序MSD没有足够时间升温和抽真空真空室漏气离子源温度过
18、高柱流量过大灯丝工作不正常离子源脏四极质量滤器极性不对,残留分析方法的建立步骤,1、文献检索,目的：通过文献查阅对以往分析方法进行比较和借鉴，了解与方法设计相关的背景材料。对将建立的方法进行实验条件调整，改进，根据分析对象，应用新技术建立方法。查找参数：待测物的理化性质极性，溶解性，酸碱性，稳定性，熔点，蒸汽压，波谱学性质等。查阅范围；一般便捷的方法是查阅英国皇家化学会出版的Analytical abstract即“AA”或.美国化学会的。,2、建立测定方法,建立测定方法，线性范围：根据选定对象（分析对象残留，测定对象），建立拟采用的测定方法，配制标准系列，优化测定条件，排除抗干扰物质，建立标
19、准曲线。GC检测器ECD、NPD、FID、FPD、TCD、MSD等均可作为农药的检测用，但实际应用在残留检测的是ECD、NPD、FPD、MSD对该几种检测器的检测限，测定对象，分离条件进行优化选择。定期或不定期采用标准系列在不同测定环境（时间，温度等）整个校正，绘制质量控制图。以测定时间为横坐标，（该时间要标明标准汇制情况，溶剂，温度等参数），测定值（变动范围）为纵坐标（绘制质量控制图）,3、建立样品处理方法,准备样品：三种样品（空白样品，纯水，添加样品）以纯水为样品基质预试验，初步确定提取溶剂试剂干扰情况，不同条件下的回收率用空白样品，添加样品进行测试,4.提取,A、残留在样品基质中的待测物
20、浓度一般较低PPM级甚至PPB级，如此低含量的残留物质提取除了考虑待测物的理化性质外，更主要的是考虑样品基质种类。一般而言，有机氯农药为脂溶性的，极性较低，可以采用索氏提取油脂，而有机磷农药具一定水溶性，可采用丙酮、二氯甲烷等直接提取，拟除虫菌脂类农药多采用混合提取溶剂通过液一液萃取（LLE）法提取，而有机氮类农药则考虑酸碱性等情况。,B、溶剂回流，研磨捣碎，振荡，旋涡振荡，超声波振荡，均质器均质等是提取常采用的手段，根据样品种类使用溶剂情况可选用不同提取方法，随着分析科学的发展，现代分离分析技术也应用于残留物提取中，在一些实验室已广泛采用的有超临界萃取提取，基质因相分散提取，溶剂提取因相缴萃
21、提取等方法，其共同特点是仪器自动化程度高，试剂用量少，环境污染物少，易与测定技术一体化。,C、提取效果的评定，一般而言是采用添加回收试验方法来判断，即选用比较成熟的“净化”和“测定”的分析条件，更换“提取”条件，来添加回收试验回收率结果，比较该结果进行判断，该提取效果常比真正的提取率高。考虑到添加于试样中的农药与实际试样中残留的农药存在状态不同的缘故。国外一些研究机构采用同位素的化学性质一致性原理。进行放射性同位素标记，用闪烁计数器测定提取前后的放射性强度，获得提取率来判断提取效果，这是一种较可靠的方法。,5.净化,A、与提取液中大量存在的溶剂色素油脂，天然物相比待测残留物仍然是极少量的，对于
22、测定方法而言大量杂质的存在会干扰待测残留的测定，显然必须采用一定净化手段以达到测定的必须的条件。,B、采用不同的检测器，对净化的要求也有所不同，FPD、NPD对净化的要求不高，而MSD、ECD由于其易受污染对净化的要求较高。,C、净化方法有柱层析法，包括吸附柱层析法，分配柱层析法，凝胶渗透柱层析法。吸附柱层析法，即被测试样各组分在层析柱中吸附剂上被吸附与被解吸的反复过程，常用的吸附剂有弗罗里硅土，氧化铝，活性炭，硅胶，氧化镁，纤维素等。分配柱层析法即在柱内装惰性填充物（载体），其常因地吸附着某一种溶剂，向柱中加入淋洗溶剂使试样在丙中反复分配。,凝胶渗透层析法是将多孔凝胶填入柱内，用溶剂淋洗利用
23、凝胶的网眼大小来筛分，使分子量大小不同的化合物达到分离的目的。薄层层析法，凝固法，液一液分配法，扫集共蒸馏净化法，低温冷冻净化法，前置色谱净化法，水蒸气蒸馏等到也常作为净化方法应用与残留检测中。,常用色谱仪的维护与保养,前言,如果使用得当，保养得法，完全可以也应当正常运转相当长时间。真正难的是如何保证使其长时间可持续正常运行的状态。维护与保养的一个重要作用就是保障保养一个良好的检测状态,确保得到准确的检测数据。,影响分析仪器持续运行的因素,1、易损件清理更换不及时、2、硬件使用不科学、3、仪器本身选购及配置不当。共性就是：“仪器本身各个固定部件很少出问题，只有使用者经常接触到的地方才容易出故障
24、”。,第一部份 气相色谱仪,在使用气相色谱仪时（以下主要以配有分流进样口和氢火焰检测器的气相色谱仪为例），使用者经常做的对仪器结构有改变的行为莫过于换柱了，虽然换柱和扎针一样，都是气相色谱工作者的基本功。但是至少有一半的问题与之相关。,问题1：漏气,进样垫漏气，接柱的固定、螺丝漏气，尤其是使用填充柱而又采用硅石墨垫更会如此。如果用橡胶圈好些，但是不需用，需要定期更换。毛细柱由于采用石墨垫圈则漏气问题相对好些。,问题2：固定位置不准,这是制约灵敏度的一个关键点。填充柱由于是刚性的，尺寸形状固定，在换装时一般容易掌握。常出问题的是毛细柱，由于其本身柔性，在进样口和检测器内的长度完全由使用者个人掌握
25、，如果把握不准，会成为制约实验效果的一个重要因素。不同公司仪器的装柱尺寸是不同的，在使用不同衬管时也有很大区别。有些仪器提供了专用的测量工具，有些则没有。,问题3：清理更换不及时,这是硬件无故障而检测状态不好的主要原因，其具体表现就是污染。如：进样口衬管及玻璃棉污染，柱内污染，检测器污染，如果不及时更换或清洗，会造成基线不稳，灵敏度下降等现象。,对策：,定期清洗，定期更换，用检漏液测漏，是常用但不是最好的处理方法。我觉得，最好的方法是状态监控，时刻观察系统状态，发现问题马上判断问题再处理问题。同一台机，同一根柱，在同一流量，同一柱头压下，应该有基本一致的信号基线和差不多的稳定时间，仪器状态的不
26、同问题会有各种不同的反映。（仪器的信号远不只检测信号那么简单，它不权表述了实验对象，也表述了仪器本身的状态）,例1,装柱后，通上一定的流量，柱头压和平时不一样，如果柱头压明显比平时高，可能是柱头堵塞。如果低，可能是漏气或柱断裂，漏气可以在关闭柱箱风扇后应该能听到声音，柱断裂可以很容易看出来。,例2,流量正常，柱头压正常，但基线信号明显低且稳定奇快。这种现象在使用毛细柱时常发生，原因多半是喷嘴堵塞。确定是否这个原因的方法就是进空白溶剂，如果信号比平时低了很多，而且出峰时间又晚了一些，就基本就是这个原因，这时只能关机清洗。,例3,流量正常，柱头压正常，在三温（OVEN，INJ，DET）到达设定值后
27、，但基线信号明显地偏高且不稳定。这种情况多是污染。污染又分：进样口污染，柱污染，检测器污染。确定是哪一种故障并不容易（有时还是交叉反应），但是处理方法却一致：停机清洗升温烤。我建议每次清洗最好把检测器和进样口都处理一下，毕竟最耗时间的是降温升温。,以上三个例子都强调了一个“与平时不同”。这就需要我们在做实验时有一个长期的状态观察积累。（不同检测器有不同的特性，以上针对FID）,第二部分 气质联用仪,气质联用仪可以看作是毛细管柱气相色谱仪加上质量检测器的组合。它常出的问题也是两者相加。我们对气质联用仪本身的操作一般是换柱和清洗离子源，大多数问题也是由这两步操作而来。它们最主要的表现主是漏气而造成
28、的抽真空不正常。出问题的位置在于毛细管柱进入质谱腔体开门时的密封圈。,毛细管柱进入质谱腔的接口密封不严：需要注意的有：1、伸入质谱腔中的长度不适当，太长或太短都不行。2、垫圈要松紧合适，太松会有漏气的隐患，太紧则会压碎垫圈。清洗离子源时打开腔体后密封不严：门上的密封圈（岛津的是门，安捷伦的是盖）上只要沾了一点点肉眼无法察觉的毛发或绒线就会引起漏气。这时一般操作书上要求的都是戴上尼龙手套清洁，但这对于处理离子源时是很重要的，但是对于处理密封圈来说，不戴手套的效果更好。,原因是手上多少会有一些油脂，只要沿着密封圈抹上一圈，可以有效地消除绒线的影响。而这些油脂离加热源远，和离子源也远，基本属大分子有
29、机物，对于检测没有影响。平时操作质谱时，要对在通气和不通气的情况下，多长时间真空度能达到多少有一个大致的数值概念标准。如果换柱或清洗离子源后，抽真空的速率比平时差距太远，就要先考虑是否是安装不当漏气的问题，早些降温关机处理。,溶剂延迟是其它气相检测器没有的概念，如果忘记设置合理的溶剂延迟时间，会对灯丝造成严重的损害，这是质谱初学者常犯的错误。另一个可能造成严重后果的行为是：没有等温度降到室温就急着拆机拆离子源，曾经发生过在热的时候拆机，冷了以后装不回去的案例。,在实验状态方面，主要还是污染问题。进样口和柱污染析处理和普通气相一致，至于质谱检测器，一般来说，80%以上的污染是在离子源部分。我们需
30、要对调谐后电压时常注意，升高到一定程度就要考虑是否要清洗离子源了，而四极杆部分一般不用动，最好也不要由用启动。气质联用的日常保养容易忽视的是机械泵的保养，主要是换机油和分子筛。特别提示：买气质时千万别忘记配UPS。,第三部分：液相色谱仪,液相色谱仪是属于易学难用的仪器，特别讲究“正确使用”和经验。液相工作者接触最多的是流动相，也就是流动相，是造成液相色谱各种问题的最主要源头。液相色谱最常见的故障一是堵，二是漏。下面就这两点分别展开讨论。（注：流动相以甲醇为例，色谱柱以C18为例）,“堵”的表现现象就是柱压异常升高，直接原因就是流路不畅。堵塞的主要位置就是在色谱柱的前端，最主要原因就是流动相里有
31、杂质，杂质的主要来源就是细菌。“堵”的原因之一：配制流动相时细菌污染。首先我们要认识到，一般的国产甲醇其实不需要额外过滤处理，直接使用没有问题。即使是有些固态微粒杂质，也能在液相流路系统最前端的过滤头上排除，真正容易引起问题的，是水中的细菌。新制备的纯水在室内放置几天就会长菌，而这些细菌虽然肉眼不可见，却足以堵塞柱填料颗粒的空隙，造成柱子很快报废。这就是在配制流动相时造成的细菌污染的原因，解决它的方法很简单，就是确保水的可靠性。,这里有两种方式推荐：（1）最理想的方式当然是购买实验室专用纯水机，既方便又可靠，质量也放心。唯一的缺点就是价格不菲。（2）成箱购买市售品牌纯净水，如500ml一支的怡
32、宝或娃哈哈，这些水的质量足以应付液相色谱的要求。先随机抽取一支做一下细菌平板实验，待菌落数合格方可使用。这样每次只要单独开一支即可，也很方便。每次成本2元左右。这里特别指出一个细节：在绝大多数书本上，凡谈到配制流动相都会谈到最后一个过滤的步骤。但是从我们长期使用的实际效果来说，只要能保证水的质量，这一步完全可以也应当去除。,原因有以下三点：（1）流动相过滤在理论上有好处，但是实际操作时由于不可能做到专瓶专用，反而容易造成的交叉污染，对于配比复杂的流动相影响更大。（2）流动相过滤在经济成本上不划算。买一套过滤装置要6000多元，且过滤器公认是比较容易损坏的设备。最主要是过滤片的成本太高，一片就要
33、几十元。按一般液相柱的正常使用寿命计算，过滤片的成本会远远高于色谱柱的成本上升。,（3）流动性过滤对于工作效率成本不划算。使用溶剂过滤器有一个预清洗、装备、使用、用后清洗，晾干的过程，至少也有一个小时的时间。这个成本也不能忽视。（4）在实际工作未发现流动相不过滤会对柱寿命有任何影响。我们起码有6年时间没有做过流动相过滤的工作，但是和国内同行相比较，在同等使用强度下我们的柱寿命是比较长的。,“堵”的原因之二：使用流动相时的细菌污染。指的是：流动相刚开始滑长菌，在使用时却产生了细菌污染。这主要是在使用多元液相色谱仪时的一种不良使用习惯造成的。举最简单的例子：50%的甲醇水流动相，有两种使用方式。一
34、种方式是在上机前就配好混合在一起，另一种方式是在流路A放纯甲醇，流路B放纯水。从单纯实验效果来说，后一种有明显的优点：首先是简单，不需要实验者另个计算配比混合，其次就是比例准确，能得到保留时间重复性极好实验效果。,但是，它有一个致命的缺陷，就是纯水在流动相瓶中几天时间就会长细菌（很多情况下不仅仅用纯水作流动相，而是用缓冲盐溶液，本身就是优质肥料，细菌长得更迅速），一旦有细菌柱子就坏得很快。所以这种方式要求操作人员每次实验都要用新制备的纯水，更要求在每次实验后把水相换掉，换成甲醇冲洗干净，这一点在实际工作中很多人意识不强，就是意识到了但多次使用中总有一两次会遗漏，但是往往这一两次就足以产生致命的
35、影响。因为液相色谱柱的堵塞是不可逆的。,所以，宁可牺牲小小的保留时间的重复性，也不要用纯水溶液作为流动相的一组。从实际实验效果来说，我建议用10%的甲醇水代替水溶液（以前我做过不同比例甲醇水的细菌总数实验，在5%就基本可以抑菌，在10%及以上就可以完全杀菌了），这样可以有效排除长细菌的隐患，既可作流动相，也可冲柱。就算是在配制流动相时会计算得麻烦一些，但是一次麻烦，终身受益。,“堵”的原因之三：不适当操作。常见问题的有以下几种：（1）在更换零件时选择的型号有误，接口不是很匹配，在拧紧的时候产生变形而使得管路堵塞。（2）样品处理液净化得不干净，长期会在六通阀和柱之间形阻塞不畅。（3）在使用用手动
36、六通阀时，有些人可能由于手劲小的原因，转动的不到位，于是造成流路形成死堵，压力快速升高超过警戒值。（4）在使用金属管路作出废液管时，应当注意最好废液瓶中先放一些水，并把废液管的出口端结晶成块并造成堵塞。这种情况不常见，但却的确发生过。,“堵”的原因讲了不少，现介绍查堵的方法。在发生“堵”的现象后，就需要找出原因，主要是什么位置发生了“堵”。注意，绝大多数情况下，整个系统只会有一个地方发生堵塞。查堵的方法是从尾向前逆向分段拆开，仔细观察压力数值，如果某一个部件（柱子除外）装上和拆下时的压力差别很太，可发展变化判断。至于柱的堵塞，可以通过换同样规格的柱的压力是否一致来判断。,“漏”分两种：漏液和漏
37、气。,一、漏液液相色谱仪从流动相瓶到废液瓶之间的流路是一个全封闭体系，内部压力很高，但外部却能保证一滴不漏。如果某个部件发生漏液，那就是故障所在。漏液的原因分两种。,（1）接触硬件不当。,在更换零件如流路管或换柱时，换的接头接口不匹配，造成漏液。要注意不同公司的柱子接头很多是不同的，甚至同一家公司在不同时期生产的液相柱接头也有很大区别。,当然选项用PEEK接头是一较好是一个较好的解决方法，不仅通用性好，而且靠手拧就能保证不漏液。即使是接口本身是匹配的，但是如果操作不当也会漏液，一种不当就是力度把握不好，拧得太紧或太松；另一种不当就是致命的错误：滑丝，这是往往是动手能力不太强，螺丝钉很少拧的工作
38、者犯的错误，滑丝的后果不仅是漏液那么简单，常造成重要部件的报废。解决这个问题只能靠恶补基本功来实验，那就是拧螺丝。,（2）使用仪器不当,如果是输送泵漏液，最常见的原因就是在活塞位置缓冲盐析造成。析出的原因有两个，一是使用缓冲盐溶液时突然加入了纯甲醇而析出，这种错误很容易避免，这是尽量不要用纯的甲醇和纯水。,只要互相有10%比例就不会出现这个问题。另一原因是在用缓冲液盐溶液（不论甲醇含量有多少）作流动相时，实验结束后没有换甲醇水冲洗，使得微渗的流动相干燥形成晶体造成。不过，输送泵漏液并不是非得马上修不可，冲洗干净并在以后的使用中多加小心一般都可以正常使用。,检测器漏液是个很麻烦的事，一般都是吸收
39、池的问题，更换的费用相当高。但是并不是说一定要马上更换，还可以从实际实验效果看能否凑合使用。,二、漏气,漏液是从内部向外漏，而漏气则是外部了的气体进入液相色谱仪的流路内部形成气泡。下面按流路的方向逐个部件分析产生气泡的原因和相应解决方法。,（1）过滤头：,油液时，在流路管中有不规则但持续的小气泡产生，这时考虑的是流动相有没有脱气（需要特别提醒即使是有了真空脱气机也是要先超声脱气的，起码可以减少脱气机的工作压力并提高工作效率），如果已经脱砂压力了气，则要注意过滤头的污染也会造成这种现象。处理方法比较简单，拧下过滤头在稀硝酸中浸泡，超声半小时，洗净后装回去即可。,（2）透明流路管：,指的是在过滤头
40、和输送泵之间的那一段管路。这一个部分往往不是有点气泡，而经常是整个管中全是空气而操作人员却浑然不知，以致输送泵工作了半天才发现流动相瓶里的液体一点也没少。这也是我们常说的液相色谱仪至少一周要开机一次的原因（我们做液相一定要有“微渗”的概论）。如果长时间不用，这一段管路的液体会彻底干掉，而充满空气的管路和充满液体的管路不仔细看是分辨不出来的。这种情况对于输送泵很危险，因为泵从设计来说是输送液体而不是输送气体，内部的液体对于活塞来说起到了机油的作用，如果活塞杆还残存了一些缓冲盐，则极易拉伤，造成不可逆转的影响。,对于这种情况，要突出“预防为主”如：液相色谱使用人员要相对固定和稳定，工作中合理搭配资
41、源，每台机一周击至少作一次实验，如长期不用起码每周要冲流动相2小时。养成良好的工作习惯很重要。如果不慎出现了这种问题怎么办？我的建设是用外力使管路中充满液体。具体如下：1、找到流路管进入输送泵的接头。2、拧下来。3、用一干净洗耳球的尖端对准管路的平整切口。4、吸液体，看液面从流动相瓶里上升，至离洗耳球5cm左右时停止该动作。5、快速把接头拧回输送泵上（这个过程可能会有少许流动相外泄，这是正常现象）。6、开机，打开排液阀门，启动输送泵。7、等排液管中流出的溶液没有气泡时，再关闭排液阀，仪器正常工作。,（3）输送泵和柱子：,这些部分进了气泡一般不怕，冲掉就行。,（4）检测器：,应该说，整个流路中只要有一个气泡都会在检测器上得到强烈的信号反映，检测器内部的气泡一般都能被冲走，但也有很难冲掉的残留气泡的情况。如果检测器内有残留气泡，会有特征明显的表现形式，就是在走基线时会时不时间隔出现直上直下信号很大的信号峰。这时先看普通流量能否冲走，如果冲不走，那唯一的办法就是拆柱，把检测器直接连接到输送泵的出口，加大几部流量冲洗，则肯定能冲走气泡。,
