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1、4A15基因在毕赤氏酵母中的分泌表达及初步纯化,Alade,毕赤氏酵母作为表达载体的优点,1、表达效率高，遗传稳定性好2、结构简单，表达调控机理比较清楚3、有Pr加工系统4、培养简单，成本低廉5、表达产物可分泌至培养基中而自身蛋白的分泌却很少，利于下游的纯化（毕赤氏酵母是近年来广泛应用的真核表达系统。）,一、实验材料,DH5、pPICZA、GS115、TOP10、，pQE4A15pMD18T载体、Pfu高保真酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶.PCR产物纯化试剂盒、质粒提取试剂盒、羊抗鼠IgG-HRP、增强型HRP-DAB、底物显色试剂盒.,基因在毕赤氏酵母中表达的简单过程,4A15基因的获取
2、(PCR)目的基因的修饰与克隆表达载体的构建毕赤氏酵母的线性化、电转化与鉴定目的基因在毕赤酵母GS115中的表达重组蛋白的鉴定与分析重组 4A 15 的初步纯化,1、目的基因4A15获取-PCR,在设计 N 端引物时引入Xho酶切位点及 Kex2 信号肽水解位点，并删除 Kex2后面的 Ste3 位点（Glu-Ala-Glu-Ala）在下游引物（5 GC TCT AGA TTG ATG ATG AACTTC ATA 3）引入终止密码子和Xba酶切位点，,目的基因4A15获取-PCR,以 pQE4A15 为模板，进行 PCR 扩增，扩增条件为 943 min，9430 s，5730 s，7250
3、 s，35个循环，72延伸 10 min，4保存.1.5%琼脂糖分析 PCR 产物,2、目的基因的修饰与克隆,PCR 扩增产物回收后+克隆载体 pMD18T以 1：3（V）的比例通过 T4 连接酶接，连接产物转入大肠杆菌 DH5，菌落 PCR。分析阳性菌落：挑取 4 个阳性菌落 进行序列分析.序列正确的命名为 p4A15,3、表达载体的构建,双酶切基因片段p4A15，用试剂盒回收，双酶切质质粒pPICZaA，回收大片段，定向连接，连接产物在低盐的LB 平板上培养。挑取抗性菌落提取质粒，进行双酶切鉴定。,5、毕赤氏酵母GS115的电转化与鉴定5.1电转化,1、线性化限制性内切酶 BstXI 单酶
4、切表达载体和重组质粒2、电转化电激转化毕赤酵母 GSll5 感受态细胞（转化条件：电压 1 500 V，4 ms）.,电转化完成后培养,转化物涂布于Zeocin 100 mg/L 的 YPD 平板上，28恒温培养36 h 左右，抗性平板上生长的菌落相应的命名GS115/pPICZaA 和 GS115/pPICZa4A15.,5、毕赤氏酵母GS115的电转化与鉴定5.2转化子的鉴定,提取抗性菌落的基因组DNA,(方法参见Invitrogen 酵母手册).以此基因组 DNA 为模板，pPICZaA 5 Aox1 primer 和 3 Aox1 primer 为引物进行PCR.1.5%的琼脂糖凝胶电
5、泳分析,6、目的基因在毕赤酵母GS115中表达,挑阳性克隆单菌落接种于BMGY(含酵母粉、甘油、生物素）的培养基上摇床培养（28，250 r/min 培养至 OD600 为 26）离心收集菌体，用BMMY重悬，至OD6001继续摇床。,.,每 24 h 向培养基中添加无水甲醇（诱导表达产物分泌到培养基中）至终浓度为 1%；每 24 h取样，离心收集上清液，上清液用丙酮沉淀后进行 12%SDS-PAGE 分析.对 GS115 和 GS115/pPICZaA 作同样的处理，以便于下游 SDS PAGE的分析,6、重组蛋白的鉴定与分析6.1 Western blotting,将丙酮沉淀后上清12%聚
6、丙烯酰凝胶电泳转移至硝酸纤维膜1%BSA 封闭硝酸纤维膜依次加入一抗（A42 抗体）和二抗（羊抗小鼠 HRP 标记 IgG），TBST 洗涤 5 次，HRP-DAB 底物显色试剂盒显色.,Western Blot 原理 a,Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。,Western Blot 原理 b,经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物
7、学活性不变。,Western Blot 原理 c,以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。,Western Blot操作步骤,1、蛋白样品制备2、蛋白含量的测定3、SDSPAGE电泳4、转膜5、免疫反应6、化学发光，显影，定影7、凝胶图象分析,6、重组蛋白的鉴定与分析6.2 质谱分析,从考染（考马斯亮蓝R250CBR-250,用于检测Pr的氨基和羧基）凝胶上切下重组蛋白带，进行基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱分析.,7、重组 4A
8、15 的初步纯化,挑取阳性克隆单菌落接种于 BMGY 培养基中（28，250 r/min 培养至 OD600 为 26），离心收集菌体，用 BMMY 重悬，至OD6001继续摇床。每24 h 向培养基中添加无水甲醇至终浓度为 1%；培养 48 h。离心收集上清液，分别加入固体硫酸铵至其饱和度 30%40%50%60%70%。离心收集沉淀，取适量沉淀进行12%SDS-PAGE 分析。并用Band Scan 软件进行蛋白质纯度分析.,蛋白质的分离纯化方法,Alade,四种分离纯化方法,1、根据分子大小不同进行分离纯化2、根据溶解度不同进行分离纯化3、根据电荷不同进行分离纯化4、利用对配体的特异亲和
9、力进行分离纯化,1、根据分子大小不同进行分离纯化,主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法，它们经常和盐析、盐溶方法联合使用，除去无机盐。,2、根据溶解度不同进行分离纯化,影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。,3、根据电荷不同进行分离纯化,根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。离子交换层析(IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别
10、而进行分离的一种层析方法。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取,4、利用对配体的特异亲和力进行分离纯化,亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛。,.,利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428BAEEmg-1,纯化回收率达到625%。该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。,让我们每天都有收获,thats all,thank you!,
