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1、第六章 氧的供需与传递,溶氧(DO)是需氧微生物生长所必需。在发酵过程中有多方面的限制因素，而溶氧往往是最易成为控制因素。,在28氧在发酵液中的100饱和浓度只有0.25 mmol.L-1左右，比糖的溶解度小7000倍。在对数生长期即使发酵液中的溶氧能达到100空气饱和度，若此时中止供氧，发酵液中溶氧可在几秒(分)钟之内便耗竭，使溶氧成为限制因素。,第六章 氧的供需与传递,微生物细胞对氧的需求氧在液体中的溶解特性影响氧的传递速率的主要因素控制溶氧的工艺手段,第一节 微生物细胞对氧的需求,好气性微生物的生长发育和代谢活动都需要消耗氧气。在发酵过程中必须供给适量无菌空气，才能使菌体生长繁殖，积累所
2、需要的代谢产物。微生物只能利用溶解于液体中的氧。由于各种好气微生物所含的氧化酶体系（如过氧化氢酶、细胞色素氧化酶、黄素脱氢酶、多酚氧化酶等）的种类和数量不同，在不同环境条件下，各种需氧微生物的吸氧量或呼吸程度是不同的。,一、发酵过程中氧的需求,几个重要基本参数呼吸强度（比耗氧速率）单位质量的菌体(以干重计)在单位时间内消耗氧的量mmolO2/（g干细胞h）。用Qo2 表示。,一、发酵过程中氧的需求,几个重要基本参数耗氧速率 指单位体积培养液在单位时间内的消耗氧的量，以 r 表示，单位为mmolO2/Lh。,一、发酵过程中氧的需求,几个重要基本参数 r=Qo2X式中：r-耗氧速率mmolO2/L
3、h；Qo2-菌体呼吸强度 mmolO2/（g干细胞h）；X-发酵液中菌体浓度，（g/L）,一、发酵过程中氧的需求,几个重要基本参数临界氧浓度 在溶氧浓度低时，呼吸强度随溶解氧浓度的增加而增加，当溶氧浓度达到某一值后，呼吸强度不再随溶解氧浓度的增加而变化时的溶解氧浓度。用C临界表示,C临界,满足微生物呼吸的最低溶氧浓度,对产物而言,不影响产物合成所允许的最低氧浓度。在临界氧浓度以下，微生物的呼吸速率随溶解氧浓度降低而显著下降。好氧微生物临界氧浓度大约是饱和浓度的1-25。,临界溶氧浓度CCr:指不影响呼吸所允许的最低溶氧浓度。,二、微生物对氧的需求,一般对于微生物：CCr:115%饱和浓度,例：
4、酵母 4.6*10-3 mmol.L-1,1.8%产黄青霉 2.2*10-2 mmolL-1,8.8%,定义：氧饱和度发酵液中氧的浓度/临界溶氧溶度,对于微生物生长，只要控制发酵过程中氧饱和度1.,问题：一般微生物的临界溶氧浓度很小，是不是发酵过程中氧很容易满足?,例：以微生物的耗氧速率0.052 mmol O2L-1S-1 计，0.25/0.052=4.8秒(0.25 为溶解氧浓度)培养液中的溶解氧最多可用4.8秒，因此必须连续通气。,注意：由于产物的形成和菌体最适的生长条件，常常不一样：,头孢菌素 卷须霉素生长 5%(相对于饱和浓度）13%产物 13%8%,细胞培养中耗氧规律,培养初期：Q
5、O2逐渐增高，x较小。在对数生长初期：达到(QO2)m，但此时x较低，并不高。C.在对数生长后期：达到m,此时 QO2(QO2)m，xxm,D.对数生长期末：S,OTR,QO2 而(QO2,x,OTR),虽然x=xm,但 QO2、OTR 占主导地位，所以 E.培养后期：S0，QO2,二、微生物对氧的需求,影响微生物需氧量的因素很多 菌体浓度X Qo2 遗传因素 菌龄 营养的成分与浓度 有害物质的积累 培养条件,r=Qo2X,培养条件,培养基组成、溶氧浓度和发酵工艺条件等,Darlington,1964,酵母成分表示为 C3.92H6.5O1.94,从碳氢化合物和碳水化合物生成酵母的反应可用下式
6、表示：7.4CH2+6.135O2=C3.92H6.5O1.94+3.22CO2+3.98H2O6.67CH2O+2.1O2=C3.92H6.5O1.94+2.75CO2+3.42H2O,碳源的性质决定着发酵的需氧量。,菌龄,幼龄 呼吸强度大 但菌体浓度低，总的耗氧量也低晚龄 呼吸强度弱，但菌体浓度高，总的耗氧量也高,三、培养的目的不同，选取不同的供氧条件获取细胞本身：保持溶解氧的浓度高于临界溶氧浓度。从而满足微生物的最大需氧而得到最高的微生物的细胞产量。以获得细胞代谢产物为目的，溶氧对代谢产物影响有不同的情况代谢产物的生成的最佳需氧量与细胞生长的最佳需氧量相同。采用供养的浓度大于临界溶氧浓度
7、。,代谢产物的生成的最佳需氧量与细胞生长的最佳需氧量高。尽可能的提高供氧浓度。脯氨酸、谷氨酸、赖氨酸、苏氨酸等。代谢产物的生成的最佳需氧量与细胞生长的最佳需氧量低。使氧的满足度小于1，如苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、头孢霉素的生产。,四、氧在液体中的溶解特性,饱和溶氧浓度：在一定温度和压力下，空气中的氧在水中的溶解度。(mmol/L)例：25 1105Pa 0.25 mmol/L,四、氧在液体中的溶解特性,影响氧饱和浓度的主要因素（1）温度,随温度的升高气体分子的运动加快，使溶液中的氧饱和浓度下降,0.045 g/L,氧的浓度是其它营养物质浓度的10-3以下,氧在液体中的溶解特性,影响氧饱和浓度的
8、主要因素（2）溶液的性质,一种气体在不同溶液中的溶解程度是不同的同一种溶液由于其中溶质含量不同，氧的溶解度也不同。一般来说，溶质含量愈高，氧的溶解度就越小,纯氧在不同溶液中的溶解度,25及1个大气压下纯氧在不同溶液中的溶解度(mmol O2/L),氧在液体中的溶解特性,影响氧饱和浓度的主要因素（3）氧分压,气相中氧浓度增加，溶液中溶氧浓度亦随之增加25 1105Pa 空气中氧溶解度0.25 mmol/L 纯氧溶解度1.26 mmol/L,发酵过程溶氧的变化 正常发酵条件下，每种产物发酵的溶氧浓度变化都有自己的规律。（一）发酵过程中溶氧变化分为三个阶段：,发酵初期：菌体生长过程，耗氧量剧增，溶氧
9、浓度明显下降，出现一个低峰。发酵中后期:对分批发酵来说，溶氧变化比较小；在生产后期:菌体衰老，呼吸减弱，溶氧会逐步上升，当菌体自溶，溶氧上升更明显。,发酵过程中，造成溶氧异常变化的原因：溶氧异常下降的原因 溶氧异常上升的原因,污染好气性杂菌，大量的溶氧被消耗掉,菌体代谢发生异常，需氧量增加，使溶氧下降,某些设备或工艺控制发生故障或变化，引起溶氧下降,主要是好氧出现改变，如代谢异常，耗氧能力下降,染上烈性噬菌体，影响最为明显,溶解氧浓度对细胞生长和产物合成的影响可能是不同的，所以须了解长菌阶段和代谢产物形成阶段的最适需氧量。氧传递速率已成为许多好气性发酵产量的限制因素。目前,在发酵工业上氧的利用
10、率很低，因此提高传氧效率,就能大大降低空气消耗量,从而降低设备费和动力消耗,且减少泡沫形成和染菌的机会,大大提高设备利用率。,五、溶解氧控制的意义,(一)供氧的实现形式,摇瓶水平：摇床转速慢，装量多 搅拌缓和，通气缓和 表面通气，膜透析（扩散）摇瓶水平：转速快，装量少 通无菌空气并搅拌 气升式,发酵罐水平,需氧量小,发酵罐,需氧量大,(一)供氧的实现形式,摇瓶水平：摇床转速慢，装量多 搅拌缓和，通气缓和 表面通气，膜透析（扩散）摇瓶水平：转速快，装量少 通无菌空气并搅拌 气升式,发酵罐水平,需氧量小,发酵罐,需氧量大,一、供氧的实现形式,摇瓶水平：摇床转速慢，装量多 搅拌缓和，通气缓和 表面通
11、气，膜透析（扩散）摇瓶水平：转速快，装量少,发酵罐水平,需氧量小,发酵罐,需氧量大,第二节 培养过程中的传质理论,气升式,通无菌空气并搅拌,二、氧的传递阻力与传递途径,对于大多数微生物细胞的培养过程，细胞分散在培养液中，只能利用溶解氧，供氧都是在培养液中通往空气来进行。氧从空气泡传递到细胞内要克服一系列阻力，首先氧须从气相溶解于培养基中，然后传递到细胞内的呼吸酶位置上被利用。,2,1,3,4,5,6,7,8,9,气液界面,气泡,液膜,液相主体,固液界面,细胞团,液膜,细胞膜,细胞,生物反应,氧的传递,双膜理论,供氧空气中的氧从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩散到液体主流中。,耗氧,好氧微生物
12、只能利用溶解态的氧，发酵过程中不断地通过通风和搅拌，使气态中的氧经过一系列的传递步骤到液相。,供氧:气液相间的氧传递,氧的传递,供氧：空气中的氧从空气泡里通过气膜、气液界面和液膜扩散到液体主流中。耗氧：氧分子自液体主流通过液膜、菌丝丛、细胞膜扩散到细胞内,从气泡中的气相扩散通过气膜到气液界面；通过气液界面；从气液界面扩散通过气泡的液膜到液相主体；液相溶解氧的传递；从液相主体扩散通过包围细胞的液膜到大细胞表面；氧通过细胞壁；微生物细胞内氧的传递；,通常和步传递阻力最大，是整个过程的控制步骤,二、气体溶解过程：双膜理论 氧气的溶解过程是一个由气相进入液相的过程。因此，根据这一模型建立起来的气体溶解
13、理论称为双膜理论。,气相（氧）,气液接触界面,液膜,气膜,氧气在气膜中的扩散动力来自于空气中的氧的分压与界面处氧分压之差，即P-Pi，在液膜中扩散的动力来自于界面处氧浓度与液体中氧浓度之差，即Ci-CL；两种膜的阻力分别用 和 表示，则单位界面氧的传递速率为：,由于不能直接测定气膜和液膜处氧的分压、氧浓度，上试不能直接用于实际操作。如果将两膜合并起来考虑，用总传质系数和总推动力来考虑上式，则：根据亨利定律，气体的溶解度与该气体的分压成正比，可得：,为找出总传质系数与上述气膜、液膜的传递系数之间的关系，将变形，利用亨利定律，将O2浓度换成相对应的分压来表示，得：再根据提供的关系：，对于易溶气体如
14、NH3来讲，H很小，可以忽略，则，此时气体溶解的阻力主要来自于气膜阻力；同得：，对于难溶气体如O2，H很大，此时气体溶解的阻力主要来自于。,第三节 影响氧的传递速率的主要因素,氧的传递速率总方程式,OTR=K L（c*-cL）式中：OTR-单位体积培养液中的传氧速率，mol/m3s；KL-以浓度差为推动力的总传质系数（m/s)比表面积（m2/m3)KL-以浓度差为推动力的体积传递系数，（s-1）是反映发酵罐内氧传递（溶氧）能力的一个重要参数。cL-溶液中氧的实际浓度，（mol/m3）c*-与气相中氧分压p平衡时溶液中氧浓度 饱和溶氧浓度（mol/m3）,影响氧传递推动力的因素,根据气液传递速率
15、方程：OTR=K L（c*-cL）影响供氧的主要因素是推动力(C*-CL)和体积氧传递系数KLa。要提高推动力（C*CL）：必须提高C*，或降低CL,一、提高饱和溶氧浓度C*的方法,增加罐压但是要注意的是增加罐压虽然提高了氧的分压，从而增加了氧的溶解度，但其他气体成分（如CO2）分压也相应增加，且由于CO2的溶解度比氧大得多，因此不利于液相中CO2的排出，而影响了细胞的生长和产物的代谢，所以增加罐压是有一定限度的。增加空气中氧的含量，进行富氧通气操作。即通过深冷分离法、吸附分离法及膜分离法制得富氧空气，然后通入培养液。目前由于这三种分离方法的成本都较高，富氧通气还处于研究阶段。,二、降低发酵液
16、中的CL,降低发酵液中的CL，可采取减少通气量或降低搅拌转速等方式来降低KLa，使发酵液中的CL降低。但是，发酵过程中发酵液中的CL不能低于C临界，否则就会影响微生物的呼吸。目前发酵所采用的设备，其供氧能力已成为限制许多产物合成的主要因素之一，故此种方法亦不可取。,影响氧传递推动力的因素,根据气液传递速率方程：OTR=K L（c*-cL）比表面积比表面积越大，氧传递速率越大气液比表面积的大小取决于截留在培养液的气体体积以及气泡的大小。截留在液体中的气体越多，气泡的直径越小，那么气泡比表面积就越大。,三、增加比表面积,搅拌对表面积的影响较大，因为搅拌一方面可使气泡在液体中产生复杂的运动，延长停留
17、时间，增大气体的截留率，另一方面搅拌的剪切作用又使气泡粉碎，减小气泡的直径。增大通气量可增加空气的截留率，从而使比表面积增大。,影响氧传递推动力的因素,根据气液传递速率方程：OTR=K L（c*-cL）传递系数KL,四、影响传递系数KL的因素,搅拌空气线速度空气分布管 培养液的性质,表面活性剂 离子强度 菌体浓度,1、搅拌,采用机械搅拌是普通提高溶氧系数的行之有效的方法。,1）搅拌能把大的空气泡打碎成为微小气泡，增加了氧与液体的接触面积，而且小气泡的上升速度要比大气泡慢，相应地氧与液体的接触时间也就增长；2）搅拌使液体作涡流运动，使气泡不是直线上升而是作螺旋运动上升，延长了气泡的运动路线，增加
18、了气液的接触时间；,3）搅拌使菌体分散，避免结团，有利于固液传递中的接触面积的增加，使推动力均一，同时也减少了菌体表面液膜的厚度，有利于氧的传递。4）搅拌使发酵液产生湍流而降低气液界面的液膜厚度，减少氧传递过程的阻力，增大了KL值,搅拌N并不是越大越好 剪切力，对细胞损伤，对形态破坏 PG,发酵期间搅拌热,增加传热负荷,N,2、空气线速度,空气的线速度增大，增加了溶氧，氧传递系数KL相应地也增大。过大的空气线速度会使搅拌桨叶不能打散空气，气流形成大气泡在轴的周围逸出，使搅拌效率和溶氧速率都大大降低。,3、空气分布管,空气分布管的型式、喷口直径及管口与罐底距离的相对位置对氧溶解速率有较大的影响。
19、,4、培养液的性质,微生物的生命活动，引起培养液的性质的改变，特别是粘度、表面张力、离子液度、密度、扩散系数等，从而影响到气泡的大小、气泡的稳定性，进而对氧传递系数KL带来很大的影响。发酵液粘度的改变还会影响到液体的湍流性以及界面或液膜阻力，从而影响到氧传递系数KL。当发酵液浓度增大时，粘度也增大，氧传递系数KL就降低。发酵液中泡沫的大量形成会使菌体与泡沫形成稳定的乳浊液，影响到氧传递系数。,5、表面活性剂,培养液中消泡用的油脂等具有亲水端和疏水端的表面活性物质分布在气液界面，增大了传递的阻力，使氧传递系数KL等发生变化，,表面活性剂的影响,气液界面厚度,1/kL,kL 气泡变小,a 低浓度表
20、面活性剂时,以a为主,KLa 添加至一定量时,kL降至最低,KLa下降显著 再继续增加时，kL维持最低水平不再下降，而a，此时KLa从最低点有所回升,表面活性剂的浓度,KLa受两种趋势影响,表面活性剂月桂基磺酸钠（NaLSO4）浓度对KLa、KL和da的影响,6、离子强度,一般在电解质溶液中生成的气泡比在水中小得多，因而有较大的比表面积。在同一气液接触的发酵罐中，在同样的条件下，电解质溶液的氧传递系数KL比水大，而且随电解质浓度的增加，KL也有较大的增加。,7、菌体浓度,培养液中的菌体浓度对KL也有很大的影响。,细胞浓度 x，KLa(),菌丝浓度对KLa的影响,第四节 体积氧传递系数的测定,一
21、、亚硫酸盐氧化法,使用复膜氧电极进行测量的动态法,1.原理 利用亚硫酸根在铜或镁离子作为接触剂时被氧迅速氧化的特性来估计发酵设备的通气效果。当亚硫酸盐浓度为0.0180.47mol/L，温度2045之间时，与氧反应的速度几乎不变，用碘量法测定未经氧化的亚硫酸钠，便可根据亚硫酸钠的氧化量来求得氧的溶解量。,1）Cu2+作催化剂，溶解在水中O2能立即氧化SO3-2，使之成为SO4-2。（氧分子一经溶入液相，立即就被还原掉）,反应原理：,CUSO42Na2SO3+O2 2Na2SO4,2）剩余的Na2SO3与过量的碘作用,H2ONa2SO3+I2 Na2SO4+2HI,3）再用标定的Na2S2O3滴
22、定剩余的碘,2Na2S2O3+I2 Na2S4O6+2NaI,2.操作程序：,将一定温度的自来水加入试验罐内，开始搅拌，加入亚硫酸钠晶体，使SO3-2浓度约0.5mol/L左右；再加入硫酸铜晶体，使Cu2+浓度约为10-3 mol/L，待完全溶解；通空气，一开始就接近预定的流量，尽快调至所需的空气流量；稳定后立即计时，为氧化作用开始；氧化时间连续410min，到时停止通气和搅拌，准确记录氧化时间。,试验前后各用吸管取5100ml样液，立即移入新吸入的过量的标准碘液中；然后用标准的硫代硫酸钠溶液，以淀粉为指示剂滴定至终点。,3.计算方法:,N：体积溶氧系数,S：取样量,C：硫代硫酸钠浓度mol/
23、L,t：两次取样的时间间隔,P：发酵罐的罐压,优点：氧溶解和亚硫酸盐浓度无关，反应速度快，不需要特殊仪器。缺点：影响因素多，工作容积只能在480L以内测定才比较可靠。,二、取样极谱法 原理：当电压为0.6-1.0V时，其扩散电流的大小随液体中溶解氧的浓度呈正比变化。,操作：将从发酵罐中取出的样品置入极谱仪的电池中，并记下随时间而下降的发酵液中的氧浓度CL的数值KLa=Qo2X/C*-CL=斜率/C*-CL,C*,驱出溶解氧，开始通气后，在被测定的发酵罐中用氮气定时取样，用极谱仪测出溶氧浓度dc/dt=KLa(C*-CL)KLa2.303斜率Ln(C*-CL)=-KLa t+常数,三、排气法,C*,dissolved oxygen sensor,YSI dissolved oxygen sensor,控制溶氧的工艺手段,1.改变通气速率（增大通风量）2.改变搅拌速度 3.改变气体组成中的氧分压 4.改变罐压 5.改变发酵液的理化性质 6加入传氧中间介质 传氧中间介质有：1）血红蛋白；2）烃类碳氢化合物（煤油、石蜡、甲苯与水等）；3）含氟碳化物。,Thank you！,END,
