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1、直 博 工 作 汇 报 汇 报 人：李 蓓,个人简介：2003年7月毕业于河南师范大学生命科学学院生物技术专业，同年9月开始攻读山东大学生命科学学院细胞生物学专业硕士，师从张举仁教授，研究方向为植物细胞工程与基因工程。目前已修完硕士研究生培养方案规定的课程，成绩优秀。,此外，选修了基因组学与蛋白质组学专题、分子细胞生物学进展、细胞分化等博士生课程；阅读了植物分子遗传学、从基因到基因组等专业书目，在理论水平上有一定提高；除课程学习、实验室研究工作正常进行之外，还大量阅读与专业有关的各类文献资料，思路方面有了一定的扩展。,已经熟练掌握了农杆菌介导的烟草叶盘遗传 转化技术；掌握了质粒重组、DNA和R
2、NA的提取、PCR及SDS-PAGE等分子生物学技术。从黑豆及荷豆2#中克隆了hsp热诱导启动子，并进行了功能验证。参与重组酶FLP的克隆和重组酶作用位点frt 的构建，并将它们构建入植物表达载体，转化烟草进行了功能验证。,下一阶段的工作计划和目标,利用FLP/frt系统去除转基因玉米的选择标记及耐盐相关基因的聚合,实验目的：利用FLP/frt定点重组系统，获得去除选择标记基因的玉米转基因植株；利用二次转化或者有性杂交的方法获得去除选择 标记基因的基因聚合植株；探索高效获得无选择标记基因植株的途径与方法。,实验背景：选择标记基因被广泛的用于植物转基因中转化子的筛选工作，目前最常用到的选择标记基
3、因大多数为抗性标记基因(resistant marker gene)。随着转基因植物的商品化种植，抗性标记基因在生态环境和食用方面潜在的安全性隐患就成为颇有争议且悬而未决的问题，因此培育无抗性标记基因的转基因植物已成为基因工程育种的重要目标。,完全避免使用抗性标记基因 使用安全性标记基因 获得转基因阳性植株后将抗性选择标记基因除去共转化系统(Co-transformation system)以转座元件为基础的系统(Transposable element-based system)同源重组系统(Homologous recombination)染色体内部的重组系统(Intrachromosom
4、al recombination system)位点特异性重组系统(Site-specific recombination system),在植物基因工程中常用的位点特异性重组系统主要有以下几种：来自于噬菌体P1的Cre/lox系统来自于酿酒酵母的2m质粒中的FLP/frt系统 来自于接合糖酵母Zymosaccharomyces rouxxi的 pSR1质粒的R-RS 系统 来自于Mu噬菌体的Gin重组酶系统,FLP-frt 定点重组系统 来自于酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的2m质粒。该系统包括：FLP重组酶(FLP recombinase)frt(FLP re
5、combination target)重组酶作用位点,FLP酶催化frt位点间的特异性重组：根据frt位点 位置和方向的不同，催化DNA片段的倒位、切除和整合。,1993年，Lyznik等利用FLP酶的瞬时表达系统，以玉米和水稻的原生质体为材料首次证明了FLP/frt系统在植物中的定点重组功能。1994年，Lloyed和Davies通过对烟草稳定转化体的研究验证了FLP/frt系统的功能。1996年，Lyznik等通过对玉米愈伤组织的研究也证明了该系统的功能。2000年，Hong Luo等利用FLP/frt重组系统从雄 性不育的转基因拟南芥植株中获得了育性恢复的植株，表明该系统可为杂交种或杂交
6、植物的获得提供一条可供选择的途径。,工作基础：已构建植物表达载体：pCAMBIA1300-35S-flp-hpt pCAMBIA1300-35S-antiport-frt1-als-frt2pCAMBIA1300-35S-CDH-frt1-als-frt2 pCAMBIA1300-35S-hsp1-flp-hpt pCAMBIA1300-35S-hsp2-flp-hpt 已构建原核表达载体：pET-42-b(+)-FLP,图为含有重组酶FLP基因的植物表达载体pCAMBIA1300-FLP,图为选择标记基因两侧带有同向frt位点的植物表达载体,Fig.Enzyme digested chara
7、cterization of pCAMBIA1300-antiport-frt1-als-frt2 1,pCAMBIA1300-antiport-frt1-als-frt2/Xba 2,pCAMBIA1300-antiport-frt1-als-frt2/BamH3,pCAMBIA1300-cdh-frt1-als-frt2/BamH 4,pCAMBIA1300-antiport-frt1-als-frt2/Xho5,pCAMBIA1300-antiport-frt1-als-frt2/EcoR 6,/EcoT14;7,DL2000,Fig.Enzyme digested characteri
8、zation of pCAMBIA1300-flp-hpt1,pCAMBIA1300-flp-hpt/Hind2,pCAMBIA1300-flp-hpt/EcoR3,pCAMBIA1300-flp-hpt/BamH+Kpn4,DL2000,其中，pCAMBIA1300-35S-flp-hpt、pCAMBIA1300-35S-antiport-frt1-als-frt2 以及pCAMBIA1300-35S-CDH-frt1-als-frt2三种植物表达载体已经转化烟草并且得到了阳性植株；通过二次转化和共转化的方法在烟草中鉴定了FLP/frt定点重组系统的功能，得到了去除选择标记基因仅带目的基因的
9、烟草植株；,将pET-42-b(+)-FLP原核表达载体转入E.coli的DE3(BL21)株系中并进行表达，通过SDS-PAGE电泳得到了表达的FLP重组酶的48KDa的目的条带。,工作计划：构建植物表达载体:pCAMBIA1300-Ubiqutin-flp-bar(UFB)pCAMBIA1300-Actin-antiport-frt1-als-frt2(AAFA)pCAMBIA1300-Ubiqutin-PPase-frt1-als-frt2(UPFA)转化玉米芽尖及愈伤组织，成苗后经分子生物学检测得到转基因阳性植株，然后通过二次转化或有性杂交的方法获得去除选择标记基因的玉米转基因阳性植株
10、。,去除选择标记基因的基因聚合玉米植株的获得：在获得去除选择标记 基因的转单基因的阳性 植株基础上，使带有单 基因的植株之间进行有 性杂交，筛选后代以获 得基因聚合的阳性植株；,在得到转单基因的阳性植株基础之上，进行二次转化或者有性杂交，对其后代进行分子生物学检测，得到含有两个目的基因的阳性植株，将其与含有FLP重组酶的阳性植株进行有性杂交，经过检测可以得到去除选择标记基因的基因聚合植株；,在获得去除选择标记基因的转单基因的阳性植株后，利用二次转化或有性杂交的方法将第二个目的基因(其选择标记基因的两侧带有同向的frt位点)导入，在原阳性植株中的FLP重组酶的作用下将带有第二个目的基因的表达载体
11、中的选择标记基因去除，同时实现目的基因的聚合。,构建植物表达载体:pCAMBIA1300-hsp-flp-bar 转化玉米芽尖及愈伤组织，成苗后经分子生物学检测得到转基因阳性植株，通过在不同时期，不同温度条件下对植株的不同部位进行热激，诱导由热诱导启动子启动的重组酶FLP的表达，检测该酶的表达水平，以确定诱导重组酶表达的最佳条件。,探索重组酶作用位点frt的长度及串联个数对重 组效率的影响：构建不同长度的位点序列的两串联重复和三串 联重复：frt1:78bp frt2:78bpfrt1:96bp frt2:96bpfrt1:117bp frt2:144bp 将这些成对的位点序列置于需要删除的基
12、因两侧，重组质粒后转入E.coli，提取质粒鉴定后，将质粒与纯化的FLP重组酶共同孵育，检测重组事件是否发生。,一点设想：在获得去除选择标记基因的转单基因的阳性 植株A基础上，构建带有不同目的基因的植物表达载体B，使B仅在目的基因的一侧带有单一frt位点，然后用植物表达载体B对A进行二次转化，期望A中的FLP重组酶仍然发挥作用，催化两个frt位点之间的重组。经过检测，也许可以拿到含有两个目的基因，而不含标记基因的阳性植株。,请各位老师批评指正！,酿酒酵母中广泛存在的2环是双链环状的DNA质粒,其结构上最为显著的特点是存在两个599bp的反向重复序列(IR)。这两个IR序列之间容易发生重组,使2
13、环在酵母细胞中存在A和B两种不同的构型,并且对于2环在酵母细胞中维持高拷贝数具有十分重要的作用。2环分子内发生的DNA重组属于位点特异性重组,由2环自身编码的FLP重组酶催化。FLP重组酶作用的靶序列为2环的两个IR序列中48bp的FRT位点,FRT位点由3个13bp的FLP重组酶结合区和一个跨越XbaI位点的8bp间隔区所组成。,FLP重组酶可以介导三种类型的DNA重组反应:当两个FRT位点位于同一条DNA分子上,且为顺向排列时,重组的结果会导致两个FRT位点之间的DNA片段被切离;当两个FRT位点反向排列时,重组的结果则导致两个FRT位点之间的DNA片段发生倒位;当两个FRT位点分别位于两
14、条DNA分子上时,重组的结果则导致DNA发生相互易位。,The principle of Co-transformation A proportion of transformed plants carrying the selectable marker gene will also have integrated the required interest gene at a second unlinked insertion site.Marker genes can be removed by genetic segregation.,The strategy of transposa
15、ble element-based system Connecting either the interest gene or the selectable marker with transposable sequences in such a way that the two entities can be separated from each other in a controlled reaction after transformation and selection.Marker genes can be removed by genetic segregation.,Disad
16、vantage Low frequency The low frequencies partly due to the tendency of transposable elements to reinsert elsewhere in the genome.Genomic instability Excision of transposons is frequently imprecise Repeated cycles of insertion and excision may lead to the generation of mutations at numerous unknown
17、loci.,Deletion of sequences positioned between direct repeats in the genome via homologous recombination occurs at low frequencies in somatic cells.e.g intrachromosomal HR in tobacco occurs at frequencies of about 10-6.Therefore for a long time HR strategy was regarded as not feasible for removal of markers.,如果完全避免使用选择标记基因，那么需要很高的转化效率以及灵敏高效的分子生物学检测手段。如果用安全性标记基因，虽然安全性问题得以解决，但是与我们的最终目标将转基因序列减至最短是不相符的，因此最佳途径还是在选择出正确的转化子后将选择标记基因去除。,
