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1、蛋白质化学,蛋白质的层析分离,根据物质在固定相和流动相中的分配系数的不同，使分配系数只有微小差异的物质获得最大的分离效果。根据两相状态，分为：气相层析和固相层析根据层析机理，分为：吸附层析、离子交换层析、凝胶过滤层析和亲和层析,层析法的一般原理,溶质在两个互不相溶的溶剂中，它在固定相和流动相中的浓度比是一个常数，称为分配系数，这就是分配定律：或用溶质在两相中的体积表示：,层析柱分离物质示意图,塔板理论,柱子的分离效率在一定条件下主要决定于塔板数的多少,柱子的塔板数主要依赖于柱长和理论塔板高度:N=L/H=16(Ve/W)2H:理论塔板高度Ve:洗脱体积W:峰宽D值一定的条件下,提高柱效:(1)
2、增加柱长(2)降低理论塔板:降低流速和支持物的颗粒度,离子交换层析,原理:根据蛋白质分子所带电荷的不同来达到分离的目的.经化学反应将解离集团引入到惰性支持物上,通过不同的电荷来分离分子。解离离子带负电，结合阳离子，称为阳离子交换柱。带正电，结合阴离子，称为阴离子交换柱。注:pH在等电点处,分子的净电荷为0,无相互作用;pH在等电点以上,分子带负电,可结合于阴离子交换剂;pH低于等电点,分子带正电,可结合于阳离子交换剂.,离子交换层析,平衡:电荷量越大,结合越牢,在柱中移动速度越慢;电荷不同,亲和力不同.洗脱:带电蛋白质分子与交换剂的结合可逆.通常,用盐梯度和pH梯度可把吸附的蛋白质从柱上洗脱下
3、来.,离子交换剂的基本类型,离子交换的支持物,纤维素 具有松散的亲水性网络,较大的的表面积、吸附容量大，通透性好。葡聚糖凝胶(Sephadex)既有离子交换剂的性质，又有分子筛效应。琼脂糖凝胶(Sepharose)吸附容量大，能维持交好的流速和分辨率。Fast flow的Sepharose。,层析条件的选择,了解样品的性质：稳定性、不同pH下的带电情况、pH和盐浓度对活性或溶解度的影响。选择正确的离子交换剂。电荷、大小选择正确的缓冲液 合适的pH值;不能干扰洗脱液的测定。用紫外吸收法测定蛋白质时，不能用带苯环的缓冲离子；在215225 nm范围测定肽键含量时，不能用带羧基的缓冲液。阳离子交换用
4、阴离子型缓冲液：磷酸、醋酸等；阴离子交换用阳离子型缓冲液：Tris-HCl等。,柱层析技术,柱床体积至少要比结合所有样品所需要的要大25倍。层析柱应用起始缓冲液充分平衡。样品应溶在与起始缓冲液具有相同的pH和离子强度。要求高分辨率时，上样量不能时紧密的区带超过床体积的5%。洗脱可以用改变盐浓度或者改变pH来完成。具体实现可分为梯度洗脱与阶段洗脱。掌握洗脱速度。太快可能降低分辨率；太慢，洗脱峰会扩散。,离子交换剂的再生,层析一般步骤：,处理介质装柱平衡上样洗涤洗脱介质再生,离子交换层析过程图,离子交换层析过程图,习题,三个氨基酸（Leu,Asp,Lys）的混合物，经过一个sulphonoted
5、polysturene 阳离子交换树脂粒，用pH5的缓冲液洗脱，洗脱液中氨基酸出现的顺序是 AAsp,Leu,Lys;BLeu,Asp,Lys;CLys,Leu,Asp;DLeu,Lys,Asp,习题,今有以下4种蛋白质的混合物：（1）pI=10；（2）pI=4；（3）pI=8.6；（4）pI=5.若不考虑其它因素，当它们流过DEAE-纤维素阴离子交换柱，用线性盐梯度洗脱时,这些蛋白质的洗脱顺序如何，并具体说明其原因。答案:在离子交换柱上，带更多负电的吸附能力更强。四种蛋白质PI值的顺序为1342。因此，在某种pH值下，所带电荷由正到负的顺序为1342。因此，洗脱出现的先后顺序就是1342。,
6、凝胶过滤层析,原理:根据分子量的大小不同而达到分离的目的。载体是一种多孔的凝胶。分子直径比凝胶孔径大的分子,不能进入凝胶颗粒的微孔中。其他分子由大到小先后从凝胶中流出。凝胶层析支持物的性质。惰性凝胶介质，不与溶质发生反应。所带电荷低。凝胶颗粒的孔径与大小要均匀。凝胶颗粒与孔度大小的选择范围要宽，能适应不同大小分子的分离。机械强度高。常用的有交联葡聚糖Sephadex,Superdex等。,交联葡聚糖的物理性质,凝胶过滤测定样品分子量(10 kDa-250 kDa),标准分子量样品，logMW对洗脱体积作图。,凝胶过滤层析过程示意图,疏水层析,原理：根据蛋白质分子疏水性的不同而达到蛋白质分离的目
7、的。在不带电的载体上偶联上疏水基团形成疏水吸附剂，将带有非极性的生物活性物质吸附在一起，然后改变层析条件，减弱疏水作用，将吸附物质解离下来。,疏水吸附剂的制备,选择疏水胶的原则,上柱样品中加入一定浓度的盐。盐离子可以加强溶质与疏水胶的相互作用。一般要在比较高的离子强度下吸附蛋白质。各种盐对疏水作用的影响如下：,疏水层析柱的洗脱,改用低浓度的盐;降低离子强度;加乙二醇。在洗脱也中加去污剂；增加洗脱pH。从高到低的NaCl浓度梯度洗脱；或由高到低的盐浓度加由低到高的乙二醇浓度梯度洗脱。注意：离子交换：低盐吸附，高盐洗脱 疏水层析：高盐吸附，低盐洗脱,疏水柱的再生,经过处理除去紧密吸附的蛋白质和残存
8、去污剂。2柱床体积水-1体积乙醇-2体积的正丁醇-1体积的乙醇-1体积水-用初始缓冲液平衡吸附剂。,疏水层析过程示意图,亲和层析,根据特定蛋白质对某种的生物专一性来进行分离。如：酶与酶的抑制剂、抗原和抗体、酶蛋白和辅酶、激素和受体、金属结合蛋白和螯和剂、凝集素和糖蛋白有一种特殊的亲和力，在一定条件下他们可以紧密地形成复合物。因此，将复合物的一方固定在不溶性的载体上，可以从溶液中专一性地分离和提纯对方。,亲和层析,亲和层析配体的选择,能与欲分离的分子专一性地结合，并且有很强的亲和力；结合后能解离，而且无损于生物大分子的生物活性。配体上必须有适当的化学基团，通过这些基团可以将配体偶联到载体上，而且
9、这种偶联不损害配体与生物大分子的专一性的结合。,亲和层析常用配体,对特定蛋白质有亲和力的小分子配体。如酶的底物(或底物类似物)、调节配体、效应物、酶辅助因子等。对特定蛋白质有亲和力的大分子。如抗体、伴刀豆球蛋白、蛋白质类抑制剂、维生素或激素的结合蛋白或者受体等。共价亲和层析中的配体，含与目的蛋白质可逆作用的部分。,亲和层析的洗脱,非专一性洗脱 改变缓冲液的离子强度或者pH或者介电系数。使吸附的大分子的构象发生改变，以降低其与配体之间的亲和力，将吸附的大分子从层析柱上洗脱下来。专一性洗脱 选用与配体结合能力更大物质的洗脱液。eg.底物配体：底物类似物、酶抑制剂等,亲和层析过程示意图,几种特殊的亲
10、和层析,免疫亲和层析共价亲和层析固定化金属离子亲和层析,免疫亲和层析,是根据生物大分子的抗原决定部位与其抗体的结合部位之间专一性相互作用进行层析的技术。将抗体作为配体结合在层析支持物上，制成的免疫亲和柱可特异性地纯化蛋白质。,免疫亲和层析纯化人干扰素,单克隆抗体(McAb)亲和层析柱纯化重组人2a干扰素(rHuIFN-2a)1.表达rHuIFN-2a的工程菌用盐酸胍裂解，过DEAE凝胶柱粗提，收集活性峰。2.rHuIFN-2a粗提物用pH 7.2，0.15 mol/L PBS透析过夜,上样于经pH 7.2，0.15 mol/L PBS平衡的亲和层析柱，流速0.5ml/分,然后用大量PBS流洗至
11、流出液OD2800.02,再用pH 2.4,0.1 mol/L甘氨酸-HC1洗脱,洗脱液立即转至pH 7.2，0.15 mol/LPBS中透析过夜，测定蛋白浓度、纯度和活性。3.洗脱的rHuIFN-2a纯度:90,rHuIFN-2a的回收率:95,共价层析,层析材料进与样品中的一个成分发生专一性共价反应，使其保留在层析材料上。分离过程是依靠共价键的形成和断裂来实现的。对巯基专一型；对甲硫氨酸专一型 对色氨酸专一型,金属螯合层析,利用固定相载体上偶联的亚胺基乙二酸为配基与二价金属离子发生螯合作用，结合在固定相上，二价金属离子可以与流动相中含有的半胱氨酸、组氨酸、咪唑及其类似物发生特异螯合作用而进
12、行分离的方法，称之为金属螯合层析。常用的离子有：Cu2+、Ni2+、Co2+、Zn2+,样品:5 ml大肠杆菌表达含(His)-标记 谷胱甘肽转移酶，GST-(His)6柱:HiTrap Chelating 1 ml,加 Ni2+结合缓冲液:1X 磷酸缓冲液,20 mM 咪唑 pH 7.4洗脱缓冲液:1X 磷酸缓冲液,500 mM咪唑 pH 7.4流速:2 ml/min,312 cm/h结果:洗脱 GST-(His)6,4 ml,A280:1.65 总量:4.46 mg,金属螯合层析示例,高效液相层析(HPLC),一种高效的层析系统。利用高压(107pa)，使用坚硬耐高压、颗粒小的刚性材料作为支持物，装备高灵敏度的柱后检测器(紫外吸光检测器、折光率检测器、荧光检测器或电化学检测器等），进行快速的高效率的分离。离子交换、亲和层析及凝胶过滤等都可以连接上HPLC系统，进行快速有效的分离。,HPLC层析仪结构示意图,梯度装置,分析柱,分部收集器,检测仪,温度控制器,流量检定器,记录仪,数据处理,层析一般步骤：,处理介质装柱平衡上样洗涤洗脱介质再生,
