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1、实验六猪丹毒杆菌检验,一、实验目的,1、学习掌握猪丹毒杆菌检验的基本原理和方法；2、了解检验猪丹毒杆菌的意义。,二、实验说明,猪丹毒(Swine erysipelas)是由猪丹毒杆菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)引起的一种人畜共患传染病，其主要特征为高热、急性败血症、皮肤疹块、慢性疣状心内膜炎及皮肤坏死与多发性非化脓性关节炎。猪丹毒杆菌分为两个种，即红斑丹毒丝菌和扁桃体丹毒丝菌，其中仅红斑丹毒丝菌是具有致病力的毒力种，对猪最易感并有很强的致病性，至今已发现la,1b,2-24和N型共26个血清型，大约80%以上的猪源性分离株属1型(la和1b)和2型，我国优势血清
2、型也为1a,1b和2型。,“大红袍”,类丹毒,不规则鲜红色斑块,大紫肾：典型的败血脾;肾淤血、肿大,心瓣膜增生：疵状心内膜炎的病变，二尖瓣和主动脉瓣出现菜花样增生物,脾充血肿大,三、检验程序,四、操作步骤,（一）增菌 以无菌操作取检样，用乳钵加灭菌砂磨碎，无菌操作将样品转至营养肉汤中，于36士1培养8 h10h。（二）分离和培养 对没有受污染的新鲜病料可直接接种在血液琼脂或血清琼脂培养基上，37培养2448h。或经TSB肉汤37培养24h后，再转种于血液琼脂或血清琼脂培养基上，37培养24h。,血清琼脂：菌落特征：细小、圆形、透明、凸起、灰白色、有光泽、质软、露珠样、易混悬于盐水中。,血液琼脂
3、：菌落形态同血清琼脂，此外形成绿色的狭窄溶血环（溶血）,TSB肉汤：轻度混浊，振动试管呈现出云雾状，类似试管刷，有少量灰白色粘稠沉淀，不形成菌膜和菌环。,革兰氏染色，显微镜观察：分离菌均为革兰氏阳性杆菌，菌体细长、长短不一，有时呈长丝形，单独存在，有时呈短链或V形排列。,四、操作步骤,（三）生化实验自TSA琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落，接种三糖铁琼脂，先在斜面划线，再于底层穿刺。以无菌操作将各菌分别穿刺接种至SIM培养基中，将所有试管置于37下培养24-48小时。,如试管5：本试验可观察乳糖和葡萄糖发酵产酸不产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。,四、操作步骤,（三）生化实验将被检菌穿
4、刺接种于明胶培养基，于20培养7天，逐日观察明胶液化现象。如室温高，培养基自行溶化时，可与冰箱内放置30分钟，然后取出观察结果，不再凝固时为阳性。V-P试验、靛基质试验、硝酸盐还原试验检验。,四、操作步骤,（三）生化实验,（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）,猪丹毒杆菌的检测步骤1、引物：P1：5-CGATTATATTCTTAGCACGCACGCAACG-3P2：5-TGCTTGTGTTGTGATTTCTTGACG-3,猪丹毒杆菌的检测步骤2、反应体系 反应总体积为25 L，其中含有12.5 L的PCR Master Mix，10 mol/L上、下
5、游引物各1 L,1 g/L DNA模板5 L，灭菌双蒸水6.5 L。,（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）,猪丹毒杆菌的检测步骤3、反应条件：95，5min 95，1min 63，1min 40次循环 72，1min 72，10min,（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）,（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）,猪丹毒杆菌的检测步骤4、DNA的提取：将被检菌株接种于3 mL TSB肉汤中，37振荡培养(150 r/min)1012h后，取1 mL培养液于1.5
6、 mL离心管中，经12000 r/min 4离心5 min，弃去上清液，用200L ddH2O或者TE缓冲液(pH8.0)重悬沉淀，再于沸水浴中10 min，随后立即在冰中冷却，然后在12000 r/min及4条件下离心5 min，取上清液为猪丹毒杆菌基因组DNA模板。,猪丹毒杆菌的检测步骤5、电泳检测：取5L PCR产物直接经1%琼脂凝胶（含0.5g/mL溴化乙锭）电泳，凝胶成像仪上观察拍照结果。,（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）,（四）聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）,四、操作步骤,四、动物实验1.实验材料实验动物：雌性昆明小鼠，体重1822g 器材：1ml注射器，鼠笼，垫料（所有器皿均经高压消毒）。,四、操作步骤,四、动物实验2.实验步骤每组取2只小鼠，以每只0.2mL剂量进行一次性腹腔注射1只，另一只注射0.2mL无菌生理盐水，观察，分别记录小鼠死亡状况。,四、操作步骤,四、动物实验3.病理解剖和细菌分离病理解剖，观察小鼠的内脏病理变化；无菌取小鼠的脾脏，触于血清平板，37培养1218h。记录结果。,（六）结果与报告 综合以上生化试验、PCR鉴定和动物实验的结果，报告样品中检出或未检出猪丹毒杆菌。,
