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1、,第四节 环保型型微生物制剂的开发应用,环保型微生物制剂及其品种环保型微生物制剂的生产与使用 环保型微生物制剂的展望,第四节 环保型型微生物制剂的开发应用,环保型微生物制剂指将具有特定功能的有益微生物大量繁殖后制成活菌体或菌体产生的特定物质的产品，应用于环境，起到治理污染，改善环境质量及保护环境的作用。从源头控制污染，保持生态平衡，符合可持续发展原则。一、微生物降解剂二、微生物农药 三、微生物肥料四、生物表面活性剂 五、生物塑料六、微生物絮凝剂,一、微生物降解剂对污染物降解能力强的菌株扩大生产、制成产品，应用于环境的无害化处理，即是微生物降解剂。降解的对象是氰和腈化物、苯和酚、硝基化合物、石油
2、烃类、氯苯和农药、洗涤剂等多种有机物；还包括染料脱色菌、重金属吸附并转化菌、混合降解菌等。（难处理的）,生物强化技术通过向废物处理系统中直接投加从自然界中筛选的优势菌种或通过基因重组技术产生的高效菌种，以改善原处理系统的能力，达到对某一种或某一类有害物质的去除或某方面性能改进的目的的环境生物技术。应用：处理有毒有害难降解废水的处理如：制药废水、印染废水；微污染水源水的处理（生物强化过滤有效去除氨氮、亚硝酸盐、有机物、铁、锰、浊度、色度等）；垃圾渗滤液的处理（如用日本专利产品EM菌剂）。,二、微生物农药1.定义：利用微生物或其基因产生或表达的各种 生物活性成分，用于防治植物病虫害、杂 草、鼠害各
3、种制剂的总称。2.特点：高效低毒，对人畜安全无毒，不杀伤 害虫的天敌和有益生物；无残留，不污 染环境，利于保持生态平衡；许多是由 多种有效成分构成的，害虫和病原菌难 以产生抗药性；生产工艺设备简单，明显的开发优势。,1细菌杀虫剂 苏云金芽孢杆菌开发最早，应用最成功，占细菌杀虫剂总量的95以上。对800余种昆虫有不同程度的致病性，对20多种重要农作物害虫防治效果显著。伴胞晶体：芽孢形成的过程中另一端同时形成伴胞晶体。形态多种多样，主要有菱形、球形、方形、多边形和不规则形。是一种蛋白质，又称内毒素，是主要的杀虫物质。,微生物农药的主要品种简介,1细菌杀虫剂 90年代以来，第二代细胞工程杀虫剂和第三
4、代基因工程杀虫剂相继投入市场。90年代初被批准登记或进入田间试验的有10余中遗传重组杀虫剂。通过构建重组菌可以实现以下目标：扩大杀虫谱；延长杀虫毒素的特效期及改善释放性能；提高毒力和杀虫晶体蛋白的产量。,微生物农药的主要品种简介,伴胞晶体的杀虫原理,伴胞晶体,原毒素,肠道碱性条件,活性毒素片断,蛋白酶作用,昆虫中肠上皮细胞糖蛋白受体,离子通道,渗透平衡破坏细胞膨胀并瓦解,芽孢从穿孔部位进入血腔，萌发成营养细胞并迅速繁殖，害虫得败血症死亡,2病毒杀虫剂,昆虫病毒突出的特点是它们大都在宿主细胞内形成蛋白结晶性质的包含体（inclusion body）。根据包含体在寄主细胞中的部位，可分为：（1）核
5、型多角体病毒（(NPV)），多角体于细胞核内形成，包含体内含有多个病毒粒子。（2）质型多角体病毒(CPV)），多角体于细胞质内出现，包含体内含有多个病毒粒子；（3）颗粒体病毒(GV)，椭圆形颗粒状包含体存在于细胞核或细胞质内。,微生物农药的主要品种简介,杀虫机理,在宿主消化道的碱液中包含体被破坏，释放出病毒颗粒。病毒颗粒进入宿主的肠上皮细胞进行复制，以出芽的方式从细胞中释放出来，进入血淋巴，或是在感染的组织中生成大量的包含体病毒。宿主死亡分解后，包含体可以较长时间保护病毒使之不失去感染力。,病毒杀虫剂,国际上：试制20多种病毒杀虫剂，大规模工业生产的只有几种，如美洲棉铃虫NPV 杀虫剂、舞毒蛾
6、NPV杀虫剂、黃杉毒蛾NPV杀虫剂、赤松毛虫CPV 杀虫剂。我国：中国棉铃虫NPV杀虫剂、油桐尺蠖NPV杀虫剂、斜纹夜蛾NPV杀虫剂、松毛虫NPV杀虫剂、菜 粉蝶 GV杀虫剂以及病毒杀虫剂。,3真菌杀虫剂 白僵菌（Beaurevia）是广谱性寄生真菌，既可以在活体昆虫体内寄生，又可以营腐生生活，能侵染鳞翅目、鞘翅目、直翅目等的多种昆虫及螨类。白僵菌的孢子侵染虫体后，适宜条件下分生孢子萌发，在昆虫体内增殖，并分泌毒素和草酸钙结晶，破坏寄主组织，使寄主代谢紊乱，最后在虫体上生出白色的棉絮状菌丝和分生孢子梗及孢子堆，虫体变成白色僵尸。,我国使用白僵菌防治松毛虫、松针毒蛾、油桐蚜虫、茶叶毒蛾、大豆食心
7、虫、杨树天牛、玉米螟、水稻叶蝉等害虫。注意：白僵菌能感染家蚕，养蚕地区控制使用；人体吸入大量的孢子类似感冒，操作者要进行适当的防护。,4杀虫抗生素阿维菌素 大环内酯类抗生素,神经末梢受体氨基丁酸,阿维菌素,促进氨基丁酸 释放,进入细胞的氯离子增加，细胞膜超极化,细胞膜受体,神经信号传递受抑,产生菌为阿维链霉菌对昆虫、线虫、螨虫有很好的杀除效果。,促进结合于,5原生动物杀虫剂,孢子是微孢子虫生活史中唯一可在宿主细胞外生存的发育阶段，即本虫的感染期。,孢子 寄主细胞 释放原孢质 分裂体 二分裂或多分裂 重复感染 或形成母孢子,孢子,6、防病抗生素井冈霉素产生菌是吸水链霉菌井冈变种。井冈霉素是用量最
8、大的农用抗生素，对水稻的纹枯病、其他作物的立枯丝核菌引起的病害都有良好的防治作用。,三、微生物肥料,（一）定义及种类利用有益微生物为植物提供有效养料和促进生长的微生物制剂。分为两类，一类是增加植物营养的供应量，代表是根瘤菌肥料；另一类是通过生长刺激素对植物的刺激作用，促进对植物营养元素的吸收，或是拮抗某些病原微生物的致病作用，减轻病虫害而导致产量增加，是广义的生物肥料，植物根际促生菌即属此类。,三、微生物肥料,微生物肥料比化学肥料的优点：长期使用不会造成环境的污染与危害，作为有益的微生物群体中的一分子。但还不能从营养角度完全满足作物生长的需要，不能全部取代化肥，而是减少化肥的用量。,（二）主要
9、微生物肥料,1.根瘤菌肥料根瘤中细菌以多形态(类菌体)出现，呈棒状、T型、Y型。根瘤的结构有利于保护根瘤菌，防止其他微生物的竞争。植物与根瘤菌是互惠共生关系，植物通过光合作用合成糖类，输送到根瘤，供给根瘤菌能源，根瘤菌固氮把空气中的分子氮转化为化合态氮，再转化为谷氨酸和谷氨酰类随时输出供给植物利用，利用率可达100，不污染环境。,（二）主要微生物肥料,2.植物根圈促生菌剂大多数植物根圈促生菌产生铁载体，将铁螯合起来，限制有害微生物生长；或产生一种或多种抗生素抑制或杀死多种病原体；或对杂草有害；或诱导植物产生整体抗性。,（二）主要微生物肥料,3.菌根菌真菌和植物根以互惠共生关系建立起来的共生体称
10、为菌根。外生菌根的真菌菌丝在根外形成致密的鞘套，少量菌丝进入根皮层细胞的间隙中。植物根为真菌的生长提供能源，菌根菌为植物提供矿物质和水，还可产生植物之间的抑制物质，使生长植物对其他植物存在偏害关系，削弱外来者的竞争，以保持占据的生境。,四、生物表面活性剂,(一)生物表面活性剂的定义及性质生物在一定的生长条件下，在其代谢过程中分泌产生的具有一定的表面或界面活性的代谢产物。理化性质同化学合成的表面活性剂相似，但活性更高、无毒性，易被微生物降解，不会对环境造成二次污染，有可能成为化学合成表面活性剂的替代品。,结构特点：非极性疏水基：一般为脂肪酰基链。极性的亲水基：有多种形式，如中性脂的酯或醇功能团、
11、脂肪酸或氨基酸的羧基、磷脂中含磷的部分以及糖脂中的糖基。糖脂不溶于水，非极性糖脂溶于氯仿等憎水溶剂，而极性糖脂溶于氯仿/甲醇混合溶剂。,（二）生物表面活性剂的种类按用途可分为生物表面活性剂和生物乳化剂。生物表面活性剂是分子量低的小分子，能显著改变表面/界面张力。生物乳化剂是一些大分子物质，虽不能显著降低表面/界面的张力，但对油水界面表现出很强的亲和力，防止油滴凝聚，从而使乳状液稳定。依据他们的化学组成可分为糖脂、脂肽和脂蛋白、中性脂/脂肪酸、磷脂、聚合物和全细胞表面本身等。,（三）生物表面活性剂的生产1.生产生物表面活性剂的菌株由很多种类的微生物如细菌、放线菌、酵母菌等合成。培养基的碳源可分为
12、3类：一类是以烷烃作为碳源的微生物，如棒状杆菌；一类是以水溶性底物为碳源的微生物如芽孢杆菌；第三类是以烷烃和水溶性底物两者为碳源的微生物，如假单胞菌。,2.表面活性剂合成的代谢调节碳源的影响：培养基中的碳源是决定生物表面活性剂结构和产量的重要因素，有的微生物仅在烃类培养基上生长时才产生生物表面活性剂，但也有的只需要一些糖类和氨基酸就可以产生。可以通过向培养基中加入长链脂肪酸、烃、甘油酯等油性物质诱导，是目前研究最多的调节方式。添加烃的类型很重要，有的细菌生产表面活性剂对烃类有一定的专一性。,氮源及其他因素的影响：如C/N比可以决定假单胞菌对糖脂的生产；NaNO3 是石蜡酪杆菌 B126 合成糖
13、脂的适宜 N 源，用铵盐作N源则产量较低。提高产率的方法：调节碳源（烷烃、蔗糖）、氮源；低稀释率；诱变筛选或构建工程菌。,应用于石油开采业(石油开采微生物技术，技术)（1）微生物强化采油技术 往油层中注入某些微生物和营养物质，微生物产生表面活性物质。降低原油与水两相界面的张力，使地层毛细管孔隙中夹持的原油大量释放出来，从而提高原油采收率。微生物不但可沿注水压差方向移动，还可在油层中纵深迁移，能与水驱难以扫及的原油作用，大大提高波及效率。还会产生某些小分子的有机酸、有机溶剂等，既能降低油水界面张力，又使油层的通透性增强。,鼠李糖脂与石油磺酸盐PSD-2复配，使大庆原油的界面张力大大下降。发酵液与
14、磺酸盐B-100复合使用，使表面张力降得更低，比水驱采油提高采收率20%，成为高效廉价驱油剂。,2、在环境生物工程上的应用 增溶作用和乳化作用。污染环境中加入微生物或表面活性剂(生物的或化学合成的),能够增强憎水性化合物的亲水性和生物可利用性,使进入环境的污染物不断地降解，有助于污染环境的生物修复。糖脂类生物表面活性剂不仅可提高烷烃的去除率,而且可加速烷烃的矿化程度,缩短可被微生物利用的适应时间。,3、在食品工业和精细化工中的应用 蔗糖酯、卵磷脂、山梨聚糖等都是目前食品工业常用的乳化剂。另外,生物表面活性剂还可以用作食品加工业和精细化工中的保湿剂、防腐剂、润湿剂、起泡剂、增稠剂、润滑剂等。如生
15、物乳化剂作色拉调味剂。槐糖脂具有良好的皮肤亲和性，可作为皮肤保湿剂用于化妆品中。蔗糖酯也可以改善化妆品的洗涤性能，增加皮肤的光润和滑腻性。,（五）问题和发展前景,问题：生产成本较高 310倍 解决策略：(1)通过选育高产菌株(2)找到廉价发酵原料（3）改进发酵工艺、用先进的下游技术（4）开发出它的二次产品,提高其附加值。,五、生物塑料,已经商品化的可生物降解塑料主要包括脂肪族聚酯、淀粉-聚乙烯、热塑性淀粉共混物、聚乳酸和聚己内酯。（一）聚羟基烷酸（PHAs）的结构,当R为甲基、m为1时，单体为羟基丁酸（HB），聚合物为PHB。两种或两种以上的单体还能形成共聚物，典型代表为PHBV，是羟基丁酸和
16、羟基戊酸（HV)的聚合物。,线状的羟基烷酸的聚酯。多聚物的相对分子质量可高达2x106；PHB是100立体专一性的，所有不对称碳原子都是D(-)构型，因此PHB是高度结晶的晶体。在物理性质甚至在分子结构上与聚丙稀很相似，如熔点、玻璃态温度、结晶度、抗张度等，并且具有相对密度大、透氧率低、抗紫外线照射、具有光学活性、阻湿性和压电性等优点。,PHAs的理化性质,PHAs的用途PHAs这类热塑性聚酯可以纺丝、压膜或注塑，在工业上可以用作各类包装材料；农业上用作农用薄膜、长效农药或肥料的生物降解载体；在医药方面可作外科缝线、骨骼代用品或骨板、术后无需取出，还可用于血管替代品，长效药物的生物降解载体。,
17、PHB的生物相容性：,研究发现，PHB的降解产物D(-)3羟基丁酸是普遍存在于高等动物中的中间产物，在原核生物真核生物中发现的含有100200个单体的小分子量的PHB具有组成细胞膜离子通道组成的作用，并且在人体血浆中也检测到它的大量存在。因而有理由相信，植入哺乳动物组织的PHB不会对机体产生毒性作用。,PHB存在两个缺点：一是融化稳定性较差：其分解温度约为200度，与熔点（175度）相近。可通过发酵过程中加入3HV的前体合成PHBV共聚体或将PHB与其他多聚物混合使用来解决；二是易老化发脆：可以通过简单的淬火处理来解决。,（二）PHAs的微生物合成1.合成PHAs的主要微生物,目前研究较多的用
18、于合成PHAs的微生物有：产碱杆菌，假单胞菌属，甲基营养菌，固氮菌属；红螺菌属。这些微生物分别利用不同的碳源生产不同的PHAs。最初用来生产的有真氧产碱杆菌、固氮菌和甲基营养菌，但固氮菌的PHB产量低，甲基营养菌的PHB分子量小而被淘汰。目前大多采用真养产碱杆菌和重组大肠埃希氏菌。,PHAs的合成及调控,PHAs的发酵生产中，将发酵分为两个阶段进行控制：第一阶段为菌体细胞的形成阶段，在此阶段微生物利用基质形成大量的菌体，而PHAs的积累很少；第二阶段为多聚体形成阶段，当氮、磷、镁或氧某种营养耗尽时，细胞进入PHAs的形成阶段，在此阶段PHAs大量形成而菌体细胞基本不繁殖。,PHAs的合成及调控
19、,可采用流加发酵法对营养物质进行控制。菌体细胞形成阶段，在某些必须的营养成分成为生长限制因素之前，对其进行定量流加，延长细胞的对数期，从而可获得较高的菌体浓度。为减少生长阶段对多聚体的积累，需通过流加法控制培养液中氨离子浓度不小于200mg/L，否则会降低多聚体的最终得率。而在多聚体形成阶段，将以较低的速度限量流加氮源。流加法可以针对微生物生长和聚合物积累过程的特点实施灵活控制。,（三）PHB的提取方法,（三）PHB的提取方法,（三）PHB的提取方法3.酶法提取 4.表面活性剂次氯酸钠法,（四）PHB在环境中的降解,PHB能被土壤中发现的295种微生物降解。PHBV在好氧污水污泥培养20oC、
20、10周已降解大部分。降解的第一步是表面的OH和COOH基团数量增加，第二步是细菌解聚反应，解聚酶将高聚物降解成单体。假单胞菌的解聚酶可将PHB降解为3羟基丁酸单体、二体和三聚体，从而进入细胞参与代谢。,（五）PHAs的工业化与发展现状PHAs以细菌发酵工艺为主，最初生产价格昂贵，（PHB15美元/kg）,缺乏相应的市场竞争力，难以大规模推广应用。经过努力和探索价格降至5.58美元/kg左右，但与聚丙稀的价格（1美元/kg）仍高出许多。主要研究：菌种的改良，提高对多种原料的利用能力和转化率；发酵技术研究提高生产强度；新型反应器的研究提高传氧效率；产品提取工艺的开发。,（五）PHAs的工业化与发展
21、现状极端嗜盐菌比普通细菌产生的PHAs中的PHV（聚羟基戊酸）含量较高，可解决目前以PHB（聚羟基丁酸）制备的塑料韧性不够的问题；而且由于嗜盐菌在低盐中细胞自溶的特点，将大大简化后处理生产工艺，有望降低成本，为目前生产的PHB由于价格问题而限制大规模生产提供新的出路。,第二节环保型微生物制剂的生产与使用,一、菌种选育（一）选择大规模生产的菌种的依据1.培养基价格低廉，培养条件要求不高且易控制；2.生长速度和代谢速度快，较短的培养周期内达到微生物量及目标代谢物量较高的目标；3.抗噬菌体能力强；4.菌种不易变异退化；5.不是人畜的病原菌，不产生污染环境、危害人体的活性物质。,（二）自然筛选高效菌株
22、1.准备工作（文献调查、策略研究、方案设计）；2.采取标本（在适当的环境中取）；3.富集培养（投其所好，取其所抗）；4.平板分离；5.基础培养基培养；6.菌种初筛（平板或摇瓶发酵）；7.平板分离；8.摇瓶发酵复筛；9.平板分离；10.菌种摇瓶发酵复筛；11.接种较优的菌种斜面，进一步性能鉴定，也可作为诱变育种出发菌株。,（三）人工构建新菌株1.诱变育种2.原生质体融合复习原生质体融合的关键步骤：原生质体制备（脱去或破坏细胞壁，原生质体逸出）；原生质体融合（促融剂聚乙二醇加Ca2+、Mg2+等阳性离子，或电融合技术）；原生质体再生（高渗培养基或加入蔗糖溶液增加再生率）；原生质体的选择（营养缺陷型
23、得到互补，或用荧光染色）。黄孢原毛平革菌、土著细菌YZ1、酿酒酵母三亲株之间进行真核原核二界细胞的融合。得到Fhhh遗传工程菌具有高降解性。3.基因工程菌,二、菌数扩增与生产（一）种子培养1.种子具备的特性（1）生活力强，接种至发酵罐迟缓期较短，能迅速繁殖；（2）生理性状稳定；（3）菌体总量及浓度满足发酵罐的要求；（4）无杂菌污染；（5）保持稳定的生产能力。,2.种子制备的工艺流程保藏的菌种斜面菌种摇瓶液体培养逐级种子罐培养,（二）发酵生产注意几个关键问题：灭菌和无菌操作；合适的营养供给包括各种营养的浓度及比例；其他发酵工艺参数：温度、pH、溶解氧浓度、菌体浓度、产物浓度。,.降解石油的工程细
24、菌 70年代美国生物学家查克捡巴蒂(Chakrabarty)针对海洋输油，造成浮油污染，影响海洋生态等问题进行了研究。石油成分复杂，是由饱和、不饱和、直链、支链、芳香烃类组成，不溶于水。而海水含盐量高，虽发现90多种微生物有不同程度降解烃类的能力，但不一定能在海水中大量繁殖生存，而且降解速率也较馒，查氏将能降解脂(含质粒A)的一种假单胞菌作受体细菌，分别将能降解芳烃(质粒B)、芳烃(质粒C)和多环芳烃(质粒D)的质粒，用遗传工程方法人工转入受体细菌，获得多质粒“超级细菌”，可除去原油中23的烃。浮油在一般条件下降解需一年以上时间，用“超级细菌”只需几小时即可把浮油去除，速度快效率高。见下图。,三、微生物制剂的保存和使用,保存：04oC冷库中，适量水分使用：存活大量繁殖占优势,微生物制剂的迟效与失效问题,迟效：适应、繁殖、作用失效：自身变异，环境条件问题,
