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1、第四授课单元,第三章 质粒,第一节 质粒的发现和命名,质粒：存在于细菌、真菌等微生物细胞中、独立于染色体外、能进行自我复制的遗传因子。对于宿主，一般是非必需的通常是共价(covalent)、闭合(closed)、环状(circular)双链DNA.(但也有例外：线状DNA，RNA)附加体：整合在染色体上，或游离，并能携带宿主的染色体基因。,一、质粒的发现F质粒(1946年)，第一个被发现的质粒20世纪50-70年代：抗性质粒的大量研究，以及其他质粒的发现20世纪70年代后，质粒广泛应用于遗传工程和分子生物学研究中。,二、质粒的命名原则最初发现的质粒由研究者根据表型、大小等特征自行命名。(F因子
2、、R质粒、Col质粒等)1976年Novick提出了质粒命名原则：质粒名称一般由三个英文字母及编号组成；第一个字母一律小写p表示（plasmid）后两个字母要大写，可以采用发现者人名、实验室名称、表型性状或其他特征的英文缩写。编号为阿拉伯数字，用于区分同一类型的不同质粒。(pUC18,pUC19等),第二节 质粒编码的遗传表型,大多数质粒均控制着宿主细胞的一种或几种特殊性状，具有一定的表型，质粒可依据其表型不同可划分为以下几类：1.致育质粒2.抗药性质粒组成：转移区和抗性决定子抗药的机制：改变抗生素作用的靶点；修饰抗生素；组织抗生素进入；产生一种酶能代替宿主细胞中被抗生素作用的靶点。,3.产生
3、抗生素的质粒细菌素：细菌产生的一般只能抑制或杀死种内不同亚种或菌株中敏感细菌的特殊多肽类代谢产物。Col质粒：10种，有非接合型和接合型之分。4.产生毒性的质粒(BT)5.降解质粒：假单胞菌属是一类能广泛利用有机化合物进行生长的细菌。其体内含有大量的降解质粒。6.致病性质粒：根癌土壤农杆菌的Ti质粒；以及破伤风梭菌、肉毒梭菌和大肠杆菌等都存在致病性质粒。,7.共生固氮质粒根瘤菌普遍喊有该类质粒。包括共生质粒和非共生质粒，非共生质粒对共生作用可有正或负的调节作用。8.隐蔽质粒(cryptic plasmid)酵母的2m质粒（p171）长为2m的6kb的环状双链DNA分子位于酵母细胞核内，5010
4、0拷贝只携带与复制和重组有关的4 个基因，无遗传表型质粒上有两个600bp长的IR，被一个2.7kb区域和一个2.3kb小区域所间隔两个IR上都有一个专一重组位点(FRT)，经过重组，可使质粒互变异构成A型和B型。,第三节 质粒的检测,检测质粒的方法主要根据质粒的（遗传学特性）和（分子结构特性）。遗传特性：独特的表型、转移、人为消除等。分子结构：cccDNA和染色体相比对理化因子有更强的抗性。,一、质粒消除（理化因子和生物学方法）理化因子消除法消除剂：吖啶类，EB，某些抗生素，高温，UV等如何判断某一遗传性状的丧失是质粒消除的结果还是染色体基因突变的结果呢？回复突变情况突变率理化因子消除质粒的
5、作用机制：对质粒本身的复制和分离产生抑制作用，在生长中被淘汰选择性抑制带有质粒的菌的生长。,2.原生质体消除法使待消除质粒的菌株在一定条件下形成原生质体，在再生后生长的菌株中可出现高频率质粒消除菌。,二、遗传转移将质粒导入已经消除了该质粒的原宿主细胞，比较导入前后表型性状的差异或恢复程度。三、分子杂交在初步确定某菌株可能含有质粒的情况下，利用已知表型性状的基因片段作探针进行分子杂交，来检测其菌株是否含有该种质粒。,四、质粒的分离、检测与纯化质粒分离方法：碱变性法菌体的培养和收集溶菌碱变性处理离心分离有时为了快速提取质粒DNA，可以在提取液碱变性后，用pH4.8的醋酸钠高盐缓冲液调节pH到中性，
6、这时染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，而即使变性的质粒可以恢复到原来的构型，再通过离心，这样可以缩短提取质粒的时间。,纯化和检测方法琼脂糖凝胶电泳(质粒3种构型泳动速度不同，琼脂糖浓度，EB染色，分子量的判断)氯化铯-EB密度梯度离心电镜观察,第四节 质粒的复制与调节,一、质粒的大小和拷贝数1.大小测定表示方式：MD或kb，1MD的双链DNA1.65kb。测定方法：电泳、电镜、测序。大小范围：1200kb，个别8001000。2.质粒的拷贝数严紧型质粒(stringent plasmid)或低拷贝质粒；松弛型质粒(relaxed plasmid)或高拷贝质粒。（氯霉素可抑制细胞分离，终
7、止染色体复制，但松弛型质粒可持续复制，其拷贝数可达到10003000）。,二、质粒的复制1.质粒复制的方式(P120)质粒的复制起点称为oriV,大肠杆菌为oriC。复制主要通过型复制和滚环复制之一进行。其中以型复制为主（包括单向和双向）。质粒只编码一种或少数几种与复制有关的蛋白质，其他复制蛋白都来自宿主。,2.复制起点区oriV的功能和pBR322质粒复制起点区oriV功能与质粒载体的构建、寄主范围,pBR322质粒：pMB1的ori和rop（ROP蛋白对质粒的复制负调控）区；pSC101的tetr；Tn3的ampr。属中等拷贝质粒，1030个/细胞pUC类：高拷贝质粒（100300个/细胞
8、），也是pMB1的ori，但是没有rop。,质粒的寄主范围和质粒的拷贝数均决定于质粒的ori区域。,三、质粒复制的调控,质粒的调控一般采用直接或间接的负调控机制。负调控因子可是蛋白质、RNA或DNA重复序列。调控类型可分两类：抑制物-靶位调控(inhibitor-target regulation)重复子-竞争结合调控(iteron-binding regulation),1.抑制物-靶位调控依赖一小段反向转录的RNA作为抑制物，通过它与质粒DNA复制引物或编码Rep蛋白（复制蛋白）的mRNA的互补结合以阻止质粒复制的起始。(1)ColE1质粒复制调控（P122图5-7）,抑制物（负调控因子）
9、：反义RNA、Rop蛋白靶位：质粒复制的前提引物机制：反义RNA和引物RNA互补结合，阻止其发挥作用；Rop 蛋白具有强化反义RNA和引物RNA结合的作用。是抑制物对靶位的直接调控模型。,(2)R1质粒的复制调控 抑制物通过抑制Rep蛋白的形成而阻止了该蛋白对oriV的激活作用。是间接调控模型。抑制物：CopB蛋白：是PrepA启动子的阻遏蛋白；copA基因转录产物RNA：Rep蛋白mRNA互补，抑制其合成靶位：Rep蛋白的合成,2.重复子-竞争结合调控采用该机制进行调控的质粒为重复子质粒。在复制起始位点ori和复制基因rep附近存在着多个长度为1722bp的DNA短片段。这些短片段叫重复子。
10、重复子能与复制必需的Rep蛋白竞争性结合，从而抑制了质粒的复制和拷贝数的增加。pSC101、F、P1等都属于重复子质粒。,重复子质粒复制调控机制（两种,p124-125）(1)转录自体调控：RepA蛋白通过与自身启动子区的某些序列（如pSC101中的反向重复序列IR1和IR2）的结合而抑制自身的合成，这种方式叫做转录自体调控。,(2)偶联模型调控：由于重复子序列间的相互作用使两个质粒偶联在一起，从而抑制了质粒复制的起始，该方式即为偶联模型。质粒浓度低时，RepA蛋白只与一个质粒结合；质粒浓度高时，RepA蛋白通过与重复子序列的结合使两个质粒联结在一起，阻止质粒的复制。,F质粒的复制调控F质粒的
11、复制区也含有1922bp的重复序列，repE基因编码的RepE蛋白也是质粒复制所必需的。RepE蛋白是一种自体调控蛋白，可能也是通过与自身启动子结合对自身浓度进行调控。RepE蛋白通过与重复子序列结合抑制质粒复制。,四、质粒之间的不相容性,不相容性(incompatibility):亲缘关系相近的两种质粒，在非选择性条件下不能稳定存在于同一个细胞中，该种特性为质粒的不相容性。与质粒的复制起始的控制密切相关。同种质粒的衍生物总是不相容的；不同质粒的衍生物可能相容，也可能不相容。不相容群(incompatibility group)：不能在同一个细胞中同时稳定存在的质粒属于一个不相容群。因此，不同
12、的不相容群的质粒能同时稳定存在于一个细胞中。,五、质粒的稳定性,质粒的不稳定性包括：分离的不稳定性和结构的不稳定性。质粒分配到子细胞中的途径包括：主动分配(active distribution)和随机分配(random distribution)两种方式。,1.主动分配机理该类质粒一般为低拷贝质粒。其稳定性通过质粒编码的基因产物来实现，包括编码主动分配体系的par区和致死基因。par区：即分配区partition region，指在细胞分裂过程中使质粒拷贝数均等分配到子细胞中的质粒DNA序列。质粒的复制与分配是分开独立进行的。,F质粒的par区结构和分配机理结构（p128图5-13）：反式作
13、用基因(sopA,sopB)，顺式作用位点(sopC)。机理：sopC区的功能类似于真核染色体上的着丝粒，所以又称为类着丝粒位点(centromete-like site)。反式作用蛋白SopB与顺式作用位点sopC区结合形成成为分配复合体的蛋白-核酸复合物。该复合物参与质粒的分配。如缺失sopABC片段，质粒进行随机分配。SopA蛋白的功能：SopA蛋白和SopB蛋白属自体阻遏蛋白。SopB促进SopA和其自身启动子结合，抑制转录。控制SopB蛋白浓度。,寄主致死体系(host-killing mechanism)通过杀死细胞分裂后出现的无质粒子细胞的方式，而达到提高质粒稳定性的目的。在F质
14、粒中控制寄主致死功能的基因有ccdA,ccdB。CcdB的致死功能：抑制DNA解旋酶活性；或 引发解旋酶诱导寄主染色体DNA发生双链断裂。CcdA功能：破坏CcdB活性，抑制CcdB给寄主细胞带来的毒性。致死机制：CcdA蛋白不稳定，而CcdB稳定，因此在新产生的无质粒的细胞中，CcdB发挥起功能而杀死细胞。其它质粒的致死体系和作用机理和F质粒可能不同。（比如R1质粒）,2.随机分配机制ColE1等多数高拷贝质粒一般没有专门的par基因，可以依赖于高拷贝质粒的随机分配来实现分裂过程中的稳定性。对于分子生物学中，当细胞分裂过于旺盛或培养基耗尽时可能出现质粒丢失的细胞，可以通过选择压力的方式淘汰之。,六、质粒的转移性,自主转移质粒：质粒能自动地从一个细胞转移到另一个细胞，甚至还能带动供体细胞的染色体DNA向受体细胞转移，该种质粒被称为自主转移质粒(self-transmissible plasmid)。该类质粒只有在细菌接合时才发生转移，因此又称为接合质粒(conjugative plasmid)。如F质粒。可移动质粒：一些质粒虽不能自主转移，但能被其他一些自主转移质粒所转移，这类质粒又被叫做可移动质粒(mobilizable plasmid)。如ColE1。,
