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1、ELISA-2（乙肝两对半的检测）,临床免疫学教研室邓念华,【目的要求】,1.掌握乙肝两对半的检测原理及操作过程；2.熟悉影响乙肝两对半检测的因素；3.进一步熟悉酶标仪及洗板机使用；4.了解乙肝两对半的临床意义。,【原理】,【器材】,SM-3型自动化酶免分析仪ZMX-988B型全自动酶标洗板机微量加样器吸头等,【试剂】,HBsAgELISA试剂盒HBsAbELISA试剂盒HBeAgELISA试剂盒HBeAbELISA试剂盒HbcAbELISA试剂盒,【标本】,待测血清,【操作步骤】,准备：试剂盒各组份在37平衡30min；配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；加样品：每孔加入待测样品75
2、ul/孔，同时设置阳性对照、阴性对照，空白对照（不加样品），轻轻振荡混匀；孵育：贴上封膜，37反应60min;加酶结合物：每孔加入50ul/孔（空白对照不加），震荡10秒钟；,表面抗原检测(双抗体夹心法),孵育：贴上封膜，37 反应30min;洗板：洗板机5次，最后一次尽量扣干；显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应30min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）终止：加终止液50ul；判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度)。,结果判断及解释 COV=2.1OD阴性对照阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性O
3、D阴性对照0.10，OD阳性对照1.0OD空白对照0.04（双波长检测）,准备：试剂盒各组份在37平衡30min；配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；加样品：每孔加50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）；加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）；孵育：贴上封膜，37 反应30min；,表面抗体检测(夹心法),洗板：洗板机5次，每次洗液在孔中滞留时间10-15s，并注满反应微孔；显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）终止：加终止液50ul；判读：终止反应后10min内完成。(
4、450nm处测定吸光度),结果判断及解释 COV=2.1 OD阴性对照（OD阴性对照低于0.05按0.05计算）阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照0.10，OD阳性对照1.0OD空白对照0.015（双波长检测）,准备：试剂盒各组份在37平衡30min；配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；加样品：每孔50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）；加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）；孵育：贴上封膜，37 反应30min；,e抗原检测(夹心法),洗板：洗板机5次，每次洗液在孔中滞留时间10-15s，并注满反应微孔；显色：先加显色液A50ul，
5、再加入显色液B50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）终止：加终止液50ul；判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度)。,结果判断及解释 COV=2.1 OD阴性对照（OD阴性对照低于0.05按0.05计算）阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照0.10，OD阳性对照1.0OD空白对照0.015（双波长检测）,e抗体检测(竞争抑制法),准备：试剂盒各组份在37平衡30min；配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；加样品：每孔50ul，同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）；加酶结合物：
6、每孔50ul（空白对照不加）；孵育：贴上封膜，37 反应30min；,显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）终止：加终止液50ul；判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度),结果判断及解释 COV=0.5（OD阳性对照+OD阴性对照）阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照1.0，OD阳性对照0.05OD空白对照0.015（双波长检测）,c抗体检测(竞争抑制法),准备：试剂盒各组份在37平衡30min；配洗涤液：用纯化水按1:25将浓缩洗液稀释；加样品：
7、每孔加50ul（1:30稀释样本），同时设阳性对照、阴性对照和空白对照（不加样品）；加酶结合物：每孔50ul（空白对照不加）；,孵育：贴上封膜，37 反应30min；显色：先加显色液A 50ul，再加入显色液B 50ul，贴上封膜，37反应15min(避光)；（注：显色从加入第一滴显色液B开始计时）终止：加终止液50ul；判读：终止反应后10min内完成。(450nm处测定吸光度),结果判断及解释 COV=0.5（OD阳性对照+OD阴性对照）阳性：OD样品COV 阴性：OD样品COV 检测有效性OD阴性对照1.0，OD阳性对照0.05OD空白对照0.015（双波长检测）,1.不同品种及批号试剂组份请勿混用；2.试剂从2-8条件下取出，先在室温平衡1h；3.最好用微量移液器加各种组份；4.每次手工加样，应更换吸头；5.加样时尽量避免反应微孔中产生气泡；6.封板膜不能重复使用；,【注意事项】,7.洗液如有结晶形成建议放置37充分溶解，再稀释；8.洗板：(洗板机)1)每次使用前、后用蒸馏水或去离子水冲洗，以防止管路堵塞和腐蚀；2)加液量不能过多溢出，但又能充满整个反应微板(350ul);3)一般洗板次数不应少于5次；4)最好采用有底部冲洗和两点冲洗的程序。,
