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1、第十四章 遗传工程,利用转基因手段对生物进行人为改造的技术,什么是遗传工程？,体外DNA重组技术：利用工具酶将外源片段和载体连接，导入生物体并使其稳定复制和传代的技术,目的,研究工作生物产品(生物反应器)改良物种(提高品质)基因治疗,工具酶,A.剪切酶类有目的有选择的把目的片段切开B.连接酶类将目的片段和载体相连C.其他工具酶修饰,加工等作用,限制性内切酶II及其产生的3种不同末端,5突出的粘性末端,3突出的粘性末端,平末端,EcoR I,EcoR V,Pst I,P,P,P,P,P,P,同切酶和同粘酶,同切酶:识别相同的位点,但生成不同的末端.同粘酶:识别不同的位点,但产生相同的粘性末端,S
2、ma I 5.C C CG G G.3 3.G G GC C C.5,Xma I 5.C C CG G G.3 3.G G GC C C.5,同切酶,BamH I 5.GG A T C C.3 3.C C T A GG.5,Bgl II5.AG A T C T.3 3.T C T A GA.5,同粘酶,Sau3A5.G A T C.3 3.C T A G.5,连接酶及其对底物的要求:T4 Ligase,Ecoli Ligase,底物:自由5末端和自由3末端,5末端带磷酸基团反应条件：Mg+，ATP存在,聚合酶(polymerase):DNA聚合酶I,klenow片段,Taq,Pfu,末端转移酶
3、外切核酸酶(exonuclease):exo III,S1核酸酶,DNase I脱磷酸酶(dephosphatase):碱性磷酸酯酶CIP磷酸化酶,激酶(kinase)逆转录酶(reverse transcriptase)RNase H,RNase A甲基化酶(methylase),其它工具酶,载体及其构成基本要素,能独立复制并稳定传代:复制起始点ori或自主复制序列ARS和着丝粒,端粒方便插入外源片段:单酶切位点选择标记:药物抗性报告基因:插入筛选标记易分离提取高产率（多拷贝）强启动子多宿主,常用载体,质粒(plasmid)，粘粒(cosmid)，噬菌体，噬粒(phagemid),病毒，PA
4、C，YAC，BAC,特殊用途的载体,表达型载体，分泌型载体，穿梭载体,宿主,繁殖快,易于培养,能够快速得到产物对所携带基因的表达产物具有较高耐受性,具有克隆最多种基因的可能 突变率低,能够稳定忠实的保存被克隆基因,常用宿主,大肠杆菌:繁殖快,易培养,易分离产物噬菌体:转化效率高,易于保存酵母:繁殖最快的真核生物,适于有蛋白质加工的基因表达,lacZ,如何提高克隆效率?,提高插入片段和载体的比例尽可能采用粘端连接*载体脱磷以降低载体自连插入片段磷酸化改进转化条件,问题:,有一外源片段用某种酶切,生成了5 突出粘性末端 5-GATC,但是载体上的单酶切位点只能生成下面这几种粘性末端:5-CTAG
5、5-TCGA5-TTAA应当采用怎样的策略来提高连接效率?,不依赖于内切酶和连接酶的体外重组-位点专一性重组（依赖于短片段同源序列的重组）,cosN,LoxP,LoxP,LoxP,cre,LoxP,LoxP,Transform,+report gene substrates,新鲜组织研磨或匀浆,RNA提取液,总RNA,过oligo(dU)柱,洗脱,mRNA,AAAAAAAA,TTTTTTTTT,AAAAAAAA,AAAAAAAA,rRNA,tRNA,mRNA,筛选DNA文库,用标记的核酸作为探针用诱饵质粒筛选表达cDNA文库,探针标记,标记物：同位素标记：32P非放射性标记：荧光标记，生物素，
6、dig(地高辛）等,变性,模板DNA,随机6核苷酸引物，dNTP,某种标记dNTPDNA Pol I,5,随机引物,标记的DNA片段,REMOVE,REMOVE,Inserted DNA codingProtein for detection,GAL4-AD,lacZ,bait DNA,Inserted DNA codingProtein for detection,GAL4-AD,lacZ,bait DNA,Bait DNA,Bait DNA,PCR技术及其应用,应用范围：检测和诊断（高灵敏度）基因克隆（eg:通过部分已知序列扩增未知目标片段,其他常用分子生物学技术,丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE）脉冲电泳双向电泳Southern杂交northern杂交western杂交,转基因动植物和基因治疗,转基因动物：医学研究，生物制药转基因植物：改良品质，提高抗逆能力基因治疗：治疗药物无法根治的遗传性疾病,5C A U G3mRNA3G U A C5Antisense RNA,谢谢大家!,
