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1、第七章 蛋白质的分离、纯化与表征,分离纯化之前保证蛋白质一定的纯度依据：大小、形状、溶解度、酸碱性、吸附性及对配体的亲和性若要研究蛋白质的功能则要求高级结构完整,1、蛋白质的理化性质：酸碱性质、胶体性质与沉淀、颜色反应、变性2、分离纯化的方法：盐析、电泳、等电聚焦、层析等,蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动。这种现象称为蛋白质电泳,1、酸碱性质,可解离基团有末端和侧链故p
2、I与酸性、碱性氨基酸的数目有关如胃蛋白酶酸性氨基酸多，等电点偏酸性有些球蛋白的可解离基团只有变性后才能完全滴定,没有盐类干扰时的等电点叫等离子点,蛋白质分子的颗粒直径已达1-100nm，处于胶体颗粒的范围。因此，蛋白质具有亲水溶胶的性质。由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。,2、蛋白质的胶体性质：,蛋白质的胶体性质,布郎运动、丁道尔现象、电泳现象，不能透过半透膜，具有吸附能力,蛋白质溶液稳定的原因：1）表面形成水膜（水化层）2）带相同电荷。,蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质在适
3、当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,蛋白质的沉淀作用,加高浓度盐类（盐析）：加盐使蛋白质沉淀析出。分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出。血清球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。2.加有机溶剂加重金属盐加生物碱试剂 单宁酸、苦味酸、钼酸、钨酸、三氯乙酸能沉淀生物碱，称生物碱试剂。,在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机
4、溶剂沉淀法等。,可逆沉淀,在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。,不可逆沉淀,一、蛋白质在某些理化因素的作用下，其空间结构受到破坏，从而改变其理化性质，并失去其生物活性，称为蛋白质的变性。,二、变性的实质是破坏了蛋白质的空间结构，并不引起一级结构的改变。,3、蛋白质的变性,蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其
5、生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性(denaturation)。,在某些物理或化学因素的作用下，蛋白质严格的空间结构被破坏（不包括肽键的断裂），从而引起蛋白质若干理化性质和生物学性质的改变,蛋白质的变性,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质。所以，蛋白质的变性通常都伴随着不可逆沉淀。引起变性的主要因素是热、紫外光、激烈的搅拌以及强酸和强碱等。,变性蛋白质主要标志是生物学功能的丧失。溶解度降低，易形成沉淀析出，结晶能力丧失，分子形状改变，肽链松散，反应基团增加，易被酶消化。变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固。有些蛋白质的变性作用是可逆的
6、，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质。,引起蛋白质变性的因素有：,物理因素：高温、高压、紫外线、电离辐射、超声波等；化学因素：强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。,变性蛋白质的性质改变：,物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等；化学性质：官能团反应性增加，易被蛋白酶水解。生物学性质：原有生物学活性丧失，抗原性改变。,蛋白质变性的可逆性：,蛋白质在体外变性后，绝大多数情况下是不能复性的；如变性程度浅，蛋白质分子的构象未被严重破坏；或者蛋白质具有特殊的分子结构，并经特殊处理则可以复性。,核糖核酸酶的变性与复性,蛋白质分子相互聚集而从溶液中析出的
7、现象称为沉淀。,变性后的蛋白质由于疏水基团的暴露而易于沉淀，但沉淀的蛋白质不一定都是变性后的蛋白质。,加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,4、蛋白质的颜色反应,OH,N,大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定。,5、蛋白质的紫外吸收,蛋白质的分离与纯化方法,（一）盐析与有机溶剂沉淀：盐析：在蛋白质溶液中加入大量中性盐，以破坏蛋白质的胶体性质，使蛋白质从溶液中沉淀析出，称为盐析。,常用的中性盐有：硫酸铵、氯化钠、
8、硫酸钠等。盐析时，溶液的pH在蛋白质的等电点处效果最好。盐析沉淀蛋白质时，通常不会引起蛋白质的变性。,分段盐析：,半饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆球蛋白，而饱和硫酸铵溶液可沉淀血浆清蛋白。,2.有机溶剂沉淀蛋白质：,凡能与水以任意比例混合的有机溶剂，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可用于沉淀蛋白质。沉淀原理是：脱水作用；使水的介电常数降低，蛋白质溶解度降低。,（二）电泳：,带电粒子在电场中移动的现象称为电泳（electrophoresis)蛋白质分子在溶液中可带净的负电荷或带净的正电荷，故可在电场中发生移动。不同的蛋白质分子所带电荷量不同，且分子大小也不同，故在电场中的移动速度也不同，据此可互相分离。,电泳
9、,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。2.区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。（1）纸上电泳：用滤纸作支持物。（2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。,1）圆盘电泳：玻璃管中进行的凝胶电泳。,2）平板电泳：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,两种凝胶电泳,等电聚焦电泳：当蛋白质在其等电点时，净电荷为零，在电场中不再移动。,通电,SDSPAGE中SDS的作用：阴离子去污剂，变性，蛋白质伸展态屏蔽蛋白质的电荷，都带负电荷使得蛋白质的形状趋于一致,
10、所以在这种特殊的电泳中，迁移率与蛋白质电荷无关，与蛋白质的形状无关，取决于蛋白质的大小（分子量）,（三）层析：,层析（chromatography)是一种利用混合物中各组分理化性质的差异，在相互接触的两相（固定相与流动相）之间的分布不同而进行分离分析的技术方法。主要的层析技术有离子交换层析，凝胶层析，吸附层析及亲和层析等。,凝胶过滤分离蛋白质,（四）超速离心：,利用物质密度的不同，经超速离心后，分布于不同的液层而分离。超速离心也可用来测定蛋白质的分子量，蛋白质的分子量与其沉降系数S成正比。,蛋白质相对分子量在10 000-1 000 000之间。测定分子量的主要方法有渗透压法、超离心法、凝胶过滤法、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,最准确可靠的方法是超离心法（Svedberg于1940年设计）：蛋白质颗粒在25-50*104 g离心力作用下从溶液中沉降下来。,沉降系数（s）：单位（cm）离心场里的沉降速度。,v=沉降速度（dx/dt）=离心机转子角速度（弧度/s）x=蛋白质界面中点与转子中心的距离（cm）,沉降系数的单位常用S，1S=110-13（s）,蛋白质分子量（M）与沉降系数（s）的关系,
