用血红蛋白的提取与分离.ppt

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1、课题3 血红蛋白的提取和分离,(一)蛋白质分离和提取的原理,一.基础知识,根据蛋白质各种特性的差异:分子的形状、大小电荷性质和多少溶解度 吸附性质对其他分子亲和力,高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用,作用结果是什么被破坏?,变性、变性、空间结构,人们用鸡的红细胞提取DNA,用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?,鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行DNA的提取,人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白,(二)蛋白质提取和分离的方法,凝胶色谱法:又称分配色谱法电泳法,1.凝胶色谱法,2)材料:凝胶,(分配色谱法),1)概念 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有

2、效方法,凝胶是微小的多孔性球体,如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。,3.凝胶色谱法的原理分子筛效应,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快;小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部,路程长,流动慢。,凝胶色谱柱,洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。,2.电泳,1)概念,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程,2)原理,利用了待分离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同,使带电分子产生不同的迁移速度,从而实现样品中各种分子的分离。,3)类型:,琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳,4)实例:,SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,用途:测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度,

3、原理:SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。,讨论:如何测定蛋白质的分子量?,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时,可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳,根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置,用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线,可以测定未知蛋白质的分子量。,血液有哪些成分?,(三)缓冲溶液,抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响,维持pH基本不变,1.作用,2.配制,如H2CO3/NaHCO3,NaH2PO4/Na2HPO4,说出人体血液中缓冲液?,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而

4、成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,二.实验操作,(1)红细胞的洗涤,(2)血红蛋白的释放,(3)分离血红蛋白溶液,透析除去分子较小的杂质,通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度,二、实验操作,1.样品处理:,(二)操作过程,本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。,用鸡的红细胞提取DNA,用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么?,鸡的红细胞具有细胞核,含有DNA,便于进行DNA的提取;人的红细胞无细胞核,结构简单,血红蛋白含量丰富,便于提取血红蛋白。,1.洗涤红细胞,洗涤过程:,血液100mL,

5、重复洗涤3次,直至上清液没有黄色,速度越高和时间越长,会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀,达不到分离的效果,1.洗涤红细胞,阅读思考:洗涤的目的是什么?,除去其中的杂蛋白,以利于后续血红蛋白的分离纯化,2.释放血红蛋白,阅读思考:释放血红蛋白过程中,在洗涤好的红细胞加入 了哪些物质?2.为了加速释放过程,采取了什么措施?,目的分析:蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞破碎混合液,2000r/min的速度,(3)分离血红蛋白溶液:,过程:将搅拌好混合液转移到离心管内,以 2000r/

6、min的速度离心10 min。试管中溶液层次:第1层(最上层):甲苯层(无色 透明);第2层(中上层):脂溶性物质沉淀层(白 色薄层固体);第3层(中下层):血红蛋白的水溶 液层(红色透明液体);第4层(最下层):杂质沉 淀层(暗红色)。分离:用滤纸过滤,除去脂溶性沉淀层,于分液漏 斗中静置片刻后,分出下层的红色透明液体。,二、实验操作,2、血红蛋白的粗分离-透析:,过程:取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中,将透 析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的 磷酸缓冲液中(pH为7.0),透析12小时。透析目的:除去样品中分子量较小的杂质。,实验操作,原理:透析袋能使小分子自由进出

7、,而大分子保留在袋内。,透析过程动画演示,纯化凝胶色谱法,1.凝胶色谱柱的制作,2.凝胶色谱柱的装填,3.样品的加入和洗脱,纯度鉴定,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时,可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳,根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置,用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线,可以测定未知蛋白质的分子量。,观察你处理的血液样品离心后是否分层(见教科书图5-18),如果分层不明显,可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外,离心速度过高和时间过长,会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀,也得不到纯净的红细胞,影响后续血红蛋白的提取纯度。,三.实验结果分析与评价,1、你是否完

8、成了对血液样品的处理?你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗?,由于凝胶是一种半透明的介质,因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯,检查凝胶是否装填得均匀。此外,还可以加入大分子的有色物质,例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖,观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整,说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡,轻轻敲打柱体以消除气泡,消除不了时要重新装柱。,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生?你的色谱柱装填得成功吗?你是如何判断的?,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话,能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整,随着洗脱液缓慢流出;如果红色区带歪曲、散乱、变宽,说明分离的效果不好,这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中,红色区带的移动吗?请描述红色区带的移动情况,并据此判断分离效果?,凝胶色谱柱,注意:正确的加样操作(1)不要触及和破坏凝胶面(2)贴壁加样(3)使吸管管口沿管壁环绕移动。,样品加入与洗脱,

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