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1、课题3 血红蛋白的提取和分离,(一)蛋白质分离和提取的原理,一.基础知识,根据蛋白质各种特性的差异：分子的形状、大小电荷性质和多少溶解度 吸附性质对其他分子亲和力,高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？,变性、变性、空间结构,人们用鸡的红细胞提取DNA，用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白,（二）蛋白质提取和分离的方法,凝胶色谱法：又称分配色谱法电泳法,1.凝胶色谱法,2）材料：凝胶,(分配色谱法),1）概念 根据相对分子质量的大小分离蛋白质的有
2、效方法,凝胶是微小的多孔性球体，如葡聚糖或琼脂糖。内部有许多贯穿的通道。,3.凝胶色谱法的原理分子筛效应,大分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；小分子穿过多孔凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢。,凝胶色谱柱,洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。,2.电泳,1)概念,带电粒子在电场作用下发生迁移的过程,2)原理,利用了待分离样品中各分子带电性质的差异以及分子本身的大小、形状的不同，使带电分子产生不同的迁移速度，从而实现样品中各种分子的分离。,3)类型:,琼脂糖凝胶电泳聚丙稀酰胺凝胶电泳,4)实例：,SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳,用途:测定蛋白质的分子量 鉴定蛋白质的纯度,
3、原理：SDS能与各种蛋白质形成蛋白质SDS复合物，SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质分子原有电荷量。使电泳迁移速率完全取决于分子的大小。,讨论：如何测定蛋白质的分子量？,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。,血液有哪些成分？,(三)缓冲溶液,抵制外界的酸或碱对溶液pH值的影响，维持pH基本不变,1.作用,2.配制,如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4,说出人体血液中缓冲液?,通常由12种缓冲剂溶解于水中配制而
4、成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得在不同PH范围内使用的缓冲液。,二.实验操作,(1)红细胞的洗涤,(2)血红蛋白的释放,(3)分离血红蛋白溶液,透析除去分子较小的杂质,通过凝胶色谱法将分子量较大的杂质蛋白质除去,通过聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定血红蛋白纯度,二、实验操作,1.样品处理：,（二）操作过程,本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎 动物的血液来分离血红蛋白。,用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？,鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。,1.洗涤红细胞,洗涤过程：,血液100mL,
5、重复洗涤3次，直至上清液没有黄色,速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果,1.洗涤红细胞,阅读思考：洗涤的目的是什么？,除去其中的杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化,2.释放血红蛋白,阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入 了哪些物质？2.为了加速释放过程，采取了什么措施？,目的分析：蒸馏水的作用是_。加入甲苯的作用是_。充分搅拌的目的是_。,使红细胞大量吸水胀裂,溶解红细胞的细胞膜,加速红细胞的破裂,3.分离血红蛋白,分离过程,红细胞破碎混合液,2000r/min的速度,(3)分离血红蛋白溶液：,过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/
6、min的速度离心10 min。试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色 透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白 色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶 液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉 淀层（暗红色）。分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏 斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。,二、实验操作,2、血红蛋白的粗分离-透析：,过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透 析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的 磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。,实验操作,原理：透析袋能使小分子自由进出
7、，而大分子保留在袋内。,透析过程动画演示,纯化凝胶色谱法,1.凝胶色谱柱的制作,2.凝胶色谱柱的装填,3.样品的加入和洗脱,纯度鉴定,使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳，根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的分子量。,观察你处理的血液样品离心后是否分层（见教科书图5-18），如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。,三.实验结果分析与评价,1、你是否完
8、成了对血液样品的处理？你能描述处理后的样品发生了哪些变化吗？,由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，例如蓝色葡聚糖2000或红色葡聚糖，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。,2、你装填的凝胶色谱柱是否有气泡产生？你的色谱柱装填得成功吗？你是如何判断的？,如果凝胶色谱柱装填得很成功、分离操作也正确的话，能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、狭窄、平整，随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。,3、你能观察到蛋白质的分离过程中，红色区带的移动吗？请描述红色区带的移动情况，并据此判断分离效果？,凝胶色谱柱,注意：正确的加样操作（1）不要触及和破坏凝胶面（2）贴壁加样（3）使吸管管口沿管壁环绕移动。,样品加入与洗脱,
