疫组织化学染色sp技术.ppt

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1、武汉大学病理教研室,免疫组织化学技术的定义,免疫组织化学技术(Immunohistochemistry,IHC)是用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内的抗原(或抗体)的分布进行定位、定性、定量检测,经过组织化学呈色反应在组织原位显示抗原(或抗体),如各种蛋白质、多肽、磷脂和多糖等成分的一门新技术。,武汉大学病理教研室,免疫组织化学的应用,IHC通过检测细胞内、细胞表面或细胞间的正常或异常的物质,以研究组织细胞的正常生理、代谢及疾病的病因、发病机理,广泛用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测,细胞属性的判定、淋巴细胞的免疫表型分析、细胞增殖和凋亡的研究,以及细胞周期和信号转导的研究等。,武汉大学

2、病理教研室,实验名称,链霉菌亲和素-过氧化物酶连结法(Streptavidin-Peroxidase Conjugated Method,简称S-P法)检测胃癌组织CKVimentin的蛋白表达,武汉大学病理教研室,S-P法原理示意图,过氧化物酶,链酶亲和素,生物素,生物素化二抗,特异性一抗,待测抗原,武汉大学病理教研室,免疫组织化学基本实验流程,武汉大学病理教研室,具体步骤如下:1石蜡切片二甲苯脱蜡,梯度酒精水化,以0.01M PBS(pH 7.4)漂洗35min;2所有组织均采用微波修复抗原;3室温冷却后,0.01M PBS(pH 7.4)漂洗35min;4滴加50l过氧化物酶阻断液(试剂

3、A),37湿盒孵育 10min;50.01M PBS(pH 7.4)漂洗35min;6滴加非免疫性动物血清(试剂B),37湿盒孵育 10min;,武汉大学病理教研室,7甩去多余血清,分别滴加种抗体,4湿盒孵育 过夜,0.01M PBS(pH 7.4)漂洗35min;8滴加生物素标记的二抗(试剂C),37湿盒孵育 15min,0.01M PBS(pH 7.4)漂洗35min;9滴加链亲和素-过氧化物酶溶液(试剂D),37湿盒孵育 15min,甩去多余液体;10每片滴加新鲜配制的二甲基联苯胺(DAB)显色液,光镜下控制反应时间(约为1-5min),自来水充分冲洗,苏木素复染;11常规脱水、透明、中

4、性树胶封片并镜检分析;12阳性对照采用已知阳性片为标准,阴性对照采用PBS取代第一抗体,其余步骤相同。,武汉大学病理教研室,实验流程中的注意事项,内源性过氧化物酶的灭活 血清封闭 冲洗 抗体选择及一抗孵育时间检测及显色系统复染,武汉大学病理教研室,染色前处理 取材、脱水、浸蜡,组织及时固定 固定剂选择:10%中性缓冲福尔马林 4%多聚甲醛常规下固定8-24小时取材厚度:2mm,武汉大学病理教研室,染色前处理 预防脱片,常选用多聚耐氨酸(poly-L-lysine)注意:1)应严格控制使用次数 2)玻片洁净度,武汉大学病理教研室,染色前处理 包埋与切片,包埋:选择低熔点石蜡,温度不超过62切片:

5、厚度 3-4m 烤片:温度60,时间1小时;或602小时(迈新);或60过夜,武汉大学病理教研室,染色前处理 切片保存,切片不宜长时间在常温下保存,武汉大学病理教研室,染色前处理 脱腊,原则:免疫组化的脱蜡试剂应与常规HE 脱蜡分开,武汉大学病理教研室,实验操作中的应用,抗原修复 实验操作中的注意事项,武汉大学病理教研室,抗原修复,影响染色结果的最关键因素 抗原修复方法分类 1)酶消化法 2)加热法(高压法水煮法微波法)抗原修复液的选择 1)柠檬酸盐缓冲液()2)Tris(PH 7-8)3)EDTA(PH 8.0),武汉大学病理教研室,内源性过氧化物酶的灭活,存在部位:红细胞、横纹肌细胞、粒细

6、胞、单核细胞、肝细胞及肾细胞消除方法:3%H2O2 浸泡10分钟,武汉大学病理教研室,血清封闭,目的:减少非特异性着色 时间:一般在加载一抗之前使用,武汉大学病理教研室,冲 洗,一般采用PBS()充分冲洗增加效果 可加入Tween20,武汉大学病理教研室,一抗孵育时间及抗体选择,应选择信誉高、质量好的试剂公司抗体切忌反复冻融一抗为浓缩液时,需选择最佳稀释浓度按说明书可采用 37 1-2 小时或 4 冰箱过夜,武汉大学病理教研室,检测及显色系统,一般采用以生物素标记的辣根过氧化物酶为基础的检测方法。如SP、LSABC、ABC等 显色方法:经常采用辣根过氧化物酶系统检测,武汉大学病理教研室,显色系

7、统,常用的酶 1.辣根过氧化物酶(HRP)A:显色底物DAB-棕黄色 敏感度高、定位清晰、易于观察、保存 B:显色底物AEC-砖红色 2.碱性磷酸酶(AP)显色底物:BCIP/NBT-蓝紫色,武汉大学病理教研室,复 染,原则:注意两者之间对比,突出阳性信号,武汉大学病理教研室,实验对照设计,原则:所有检测指标均设阳性对照、阴性对照,武汉大学病理教研室,结果分析,1.特定的定位 胞膜型、胞浆型、全浆型或胞核型,局限性或弥散性。2.染色的不均一性 阳性切片的染色应分布不均,片状或点状散在分布;染色强弱也不等,颜色深浅反映抗原量的多少。,武汉大学病理教研室,3.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。4.避免人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕,色素沉着,组织细胞坏死。,

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