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1、第八讲 疫苗及其分类,疫苗（vaccine）,凡接种机体后能产生自动免疫和预防疾病的一类生物制剂均称为疫苗.细菌性菌苗病毒性疫苗寄生虫性虫苗治疗性疫苗（肿瘤、过敏和一些传染性疾病）生理调控疫苗（如促进生长和控制生殖等）,根据疫苗抗原的性质和制备工艺，疫苗又分为活疫苗（live vaccine）死疫苗（killed vaccine）基因疫苗（genetic vaccine）,一种疫病究竟以哪类疫苗最为有效可行，取决于该疫病特点，包括流行病学、病原理化特性、致病机理和免疫特点以及各种技术手段是否可行。,活疫苗,活疫苗可以在免疫动物体内繁殖；能刺激机体产生全面的系统免疫反应和局部免疫反应；免疫力持久
2、，有利于清除局部野毒；产量高、生产成本低。有毒力增强和返祖危险；有不同抗原的干扰现象；要求在低温、冷暗条件下运输和储存。,死疫苗,死疫苗不能在免疫动物体内繁殖，比较安全，不发生全身性副作用，无毒力返祖现象；有利于制备多价或多联等混合疫苗；制品稳定，受外界环境影响小，有利于保存运输。疫苗免疫剂量大，生产成本高，需多次免疫只能诱导机体产生体液免疫和免疫记忆，故常需要用佐剂或携带系统（deliver system）来增强其免疫效果。,基因疫苗,基因疫苗不能在机体增殖，但它可被细胞吸纳，并在细胞内指导合成疫苗抗原体液免疫细胞免疫反应，尤其是细胞毒T淋巴细胞（CTL）反应,活疫苗可在宿主细胞中复制毒力降
3、低免疫反应比较全面免疫剂量小免疫保护期长,死疫苗 不能在宿主细胞 中复制 无毒，不返强 免疫反应不太全 面 不会传染给其它 个体 制备技术相对容 易,DNA疫苗 可刺接抗原在细 胞内合成 可诱导细胞免疫 制备技术容易标 准化,不 同 疫 苗 特 性 比 较,疫 苗 研 究 技 术,活疫苗 经典策略-病毒 重组病毒 重组病毒载体 经典策略-细菌 重组细菌 重组细菌载体,死疫苗 完整病原体疫苗 蛋白基础疫苗 肽基础疫苗 多糖基础疫苗 抗独特型疫苗,DNA疫苗“Naked”DNA Viral delivery Bacterial delivery,弱毒疫苗（attenuated vaccine）,微
4、生物自然强毒株通过物理、化学或生物的连续传代和筛选培育而成或从自然界筛选的具有良好免疫原性的自然弱毒株，经培养增殖后制备的疫苗丧失或减弱对原宿主动物致病力，但仍保存良好免疫原性和遗传特性的毒株,重组活疫苗（recombinant live vaccine）,通过基因工程技术，将病原微生物致病性基因进行修饰、突变或缺失，从而获得弱毒株。由于这种基因变化，一般不是点突变（经典技术培育的弱毒株基因常为点突变），故其毒力更为稳定，返突变机率更小，如猪伪狂犬病基因缺失疫苗。,基因工程活载体疫苗（genetic engineering live vector vaccine）,将致病性微生物的免疫保护基因
5、插入到载体病毒或细菌（通常为疫苗毒（菌）株）的非必需区，构建成重组病毒（或细菌），经培养后制备的疫苗。该类疫苗不仅具有活疫苗和死疫苗的优点，而且对载体病毒或细菌以及插入基因相关病原体的侵染均有保护力。同时，一个载体可表达多个免疫基因，可获得多价或多联疫苗。,病毒复制非必需片段基因鉴定病毒复制非必需片段基因克隆外源基因插入非必需片段基因中间(即重组载体)将病毒基因和重组载体基因共转染至细胞，同源重组，产生感染性病毒粒子筛选稳定的重组病毒,重组病毒,重 组 病 毒 载 体,痘病毒载体(fowlpox,canarypox)疱疹病毒载体杆状病毒载体腺病毒载体RNA病毒 NDV，PRRSV，Poliov
6、irus Sindbis virus(Alphaviruses),宿主范围广、增殖滴度高、稳定性好、基因组容量大、含多个非必需区基因，易于构建和分离重组病毒，适于插入多个外源基因(40kb)，对插入的外源基因有较高的表达水平。抗原性稳定，免疫原性持久，能够同时诱发体液和细胞免疫，相对安全。痘苗病毒在种痘后局部反应较大，在人接种后有百万分之一发生全身性发痘和种痘后脑炎等并发症倾向。鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、猪痘病毒、羊痘病毒、兔痘病毒禽类痘病毒，由于用该病毒接种哺乳动物后，可以引起顿挫型感染，但却可以持续表达外源基因，并且不影响再次接种。（鸡痘病毒）,痘 病 毒 载 体,痘病毒载体中表达的外源基因
7、,HIV gag/pol，core，gp160，envNDV HA/NA，Fusion，Fusion/HA/NPPRV gp50/gp63,gp50/63/I/XMeasles F/HA,FusionRabies G Influenza HAIBDV VP2FLV env,人Ad2和Ad5：外源基因容量为20kb左右。E3：病毒复制的非必须区，允许插入的外源基因的最大长度为4.0Kb。外源基因一般不需要加基因表达调控元件，利用腺病毒本身的调节元件，即外源基因可插在E3启动子后,在感染早期有效表达。HIV-1、狂犬病毒 E1：为病毒复制必须区。缺失E1区的人腺病毒必须在特殊的工程细胞中（比如29
8、3细胞系（人胚肾细胞）或非缺失的腺病毒辅助下才能复制增殖，因此称为病毒缺陷型载体。,腺 病 毒 载 体,腺 病 毒 载 体 优点,腺病毒比较安全。腺病毒的靶细胞范围广:复制分裂细胞、非复制分裂细胞。腺病毒容易制备，对热不敏感，高滴度增殖。腺病毒可以在肠道及呼吸道繁殖，能诱导粘膜免疫，能制成 药囊经口服途径接种以预防消化道及呼吸道感染。Ad2、Ad5等启动子较强，能高水平表达外源基因，特别是换 以更强的启动子如CMV早期启动子后，更可明显提高外源基 因的表达水平。,基因组较大，约150kb，含70个编码基因，其中至少20%的基因是非必需基因，可容纳多个外源基因的插入。大多数疱疹病毒的宿主范围很窄
9、，其重组病毒的使用不会产生流行病学方面的不良后果(伪狂犬病毒除外)。许多疱疹病毒经粘膜途径感染，构建的载体活疫苗可经粘膜途径提呈抗原，诱导特异性粘膜免疫。疱疹病毒作为活载体表达外源基因作为疫苗的研究：单纯疱疹病毒、伪狂犬病毒、火鸡疱疹病毒、牛疱疹病毒I型、马疱疹病毒I型、传染性喉气管炎病毒,疱 疹 病 毒 载 体,重经典策略-细菌 相对较难重组细菌 比重组病毒困难重组细菌载体 粘膜免疫,活 细 菌 疫 苗 研 究 技 术,格氏链球菌、木糖链球菌：人的皮肤共栖菌，可作为表面定居的融合蛋白载体 乳酸杆菌：肠道和阴道内的共栖菌，但出现时间很短。肠道菌（大肠杆菌、霍乱弧菌、结肠耶耳森氏菌、志贺氏菌）大
10、肠杆菌/TGEV S蛋白的融合蛋白，CS31A:腹腔注射免疫鼠（加佐剂）刺激产生显著的血清抗体应答。大肠杆菌/艾美球虫子孢子蛋白的118氨基酸与-半乳糖苷酶融合:接种鸡，可产生保护性免疫应答。4.沙门氏菌,细菌性活载体,能运送抗原至肠道淋巴组织，并引起分泌免疫反应，其中分泌性IgA浸润所有粘膜表面及外分泌腺体的分泌物中。伤寒沙门氏菌在人体、鼠伤寒沙门氏菌在小鼠能在寄主肠道中定居，并在肠道淋巴组织、肝和脾中增殖。沙门氏菌人工突变后，它们仍能在肠道淋巴组织中定居。这些特征使减毒沙门氏菌可能作为表达各种定居因子、毒性抗原基因的载体，来递呈这些抗原到肠道淋巴组织。,沙门氏菌活疫苗载体特性,营养缺陷质粒
11、补救系统：该系统的寄主是某一营养代谢物的染色体突变株，而转移质粒则带有与寄主突变互补的非同源基因。整合表达系统：即将外源基因整合到载体的染色体中。细胞表面表达系统：即将外源基因产物表达到载体细胞表面，有利于与免疫系统接触。鞭毛表达系统：由于鞭毛是存在于细胞表面的运动器，与鞭毛蛋白融合在一起的抗原蛋白也将存在于细胞表面，同样有利于与宿主的免疫系统接触。,几种沙门氏菌活载体表达系统,病毒抗体复合物疫苗（virus-antibody complex vaccine）,该类疫苗由特异性高免血清或抗体与适当比例的相应病毒组成。可以延缓病毒释放，提高疫苗安全性和免疫效果，其关键是病毒与抗体的比例要适度。目
12、前，已研制成功并被批准投放市场的有传染性法氏囊病毒抗体复合物疫苗（美国）。,灭活疫苗（inactived vaccine）,该类疫苗由完整病毒（或细菌）经灭活剂灭活后制成，其关键是病原体灭活。既要使病原体充分死亡，丧失感染性或毒性，又要保持病原体免疫原性。目前，常用的灭活剂有甲醛、乙酰乙烯亚胺（AEI）、乙烯亚胺（BEI）和-丙酸内酯等,亚单位疫苗（subunit vaccine）,是指病原体经物理或化学方法处理，除去其无效的毒性物质，提取其有效抗原部分制备的一类疫苗。病原体的免疫原性结构成分包含多数细菌的荚膜和鞭毛、多数病毒的囊膜和衣壳蛋白，及有些寄生虫虫体的分泌和代谢产物，经提取纯化，或根
13、据这些有效免疫成分分子组成，通过化学合成，制成不同的亚单位疫苗。人工合成物纯度高，使用安全。,肺炎球菌囊膜多价多糖疫苗流感血凝素疫苗牛和犬的巴贝斯虫病疫苗等,用DNA重组技术，将编码病原微生物保护性抗原的基因导入原核或真核细胞，使其在受体细胞中高效表达，分泌保护性抗原肽链。提取保护性抗原肽链，加入佐剂即制成基因工程重组亚单位疫苗。,重组亚单位疫苗recombinant subunit vaccines,优点：,安全性好：不含传染性材料，接种后不会发生急性、持续或潜伏感染，可用于不宜使用活疫苗的一些情况。减少或消除了常规疫苗有害的反应原：热原、变应原、免疫抑制原等稳定性好：便于保存和运输，产生的
14、免疫应答可以与感染产生的免疫应答相区别，因此更适合于疫病的控制和消灭计划。将高度危险和致病的病原体的免疫原性蛋白质编码基因转移到不致病而且无害的微生物，用于大量生产，安全性更好。用于外来病原体和不能培养的病原体，扩大了用疫苗控制疫病的范围。,表达系统：原核生物：E.coli；枯草杆菌（Bacillus subtilis）真菌 昆虫细胞 哺乳类细胞 关键：研究和了解在各种表达系统中基因表 达和产物稳定性的调节和控制参数,抗独特型疫苗（ant-idiotypic vaccine）,根据免疫网络学说原理，利用第一抗体分子中的独特抗原决定簇（抗原表位）所制备的具有抗原的“内影像”（internal i
15、mage）结构的第二抗体。该抗体具有模拟抗原的特性，故称之为抗独特型疫苗。它可诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，主要适用于目前尚不能培养或很难培养的病毒，及直接用病原体制备疫苗有潜在危险的疫病。,DNA 疫 苗,裸DNA(Naked DNA)病毒携带体（Viral delivery）细菌携带体（Bacterial delivery）,基因疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。,基因疫苗被注入机体并吸收入宿主细胞后，病原体抗原的基因片段在宿主细胞内得到表达并合成抗原，这种细胞内合成的抗原经过加工、处理、修饰提呈给免疫系统，激发免疫应答。其刺
16、激机体产生免疫应答的过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种。,基因疫苗免疫机理,目的基因的分析 选择合适的表达载体 测序确认编码序列 体外转录翻译验证试验 动物试验 结果评价,研制基因疫苗的基本步骤,转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了 免疫学活性，注入动物体内能产生特异性抗体；用转基因植物组织饲喂动物，转基因植物表达 的抗原递呈到动物的肠道相关淋巴组织，产生 粘膜和体液免疫应答。,转基因植物疫苗（transgenic plant vaccine）,食用疫苗（edible vaccine）,1.整合表达系统：把编码病原体保护性抗原基因导入植物细胞内，并整合到细胞染色体上，形成表达疫苗的植
17、物品系。2.瞬时表达系统：用植物病毒为载体，将编码疫苗抗原的基因插入植物病毒基因组中。再用此重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达。,转基因植物基因工程疫苗的表达系统,按疫苗抗原种类和数量，疫苗又可分为单（价）疫苗、多价疫苗和多联（混合）疫苗,单（价）疫苗（univalent vaccine）：利用同一种微生物菌（毒）株或同一种微生物中的单一血清型菌（毒）株的增殖培养物制备的疫苗称为单（价）疫苗多价疫苗（polyvalent vaccine）：指用同一种微生物中若干血清型菌（毒）株的增殖培养物制备的疫苗。多价疫苗能使免疫动物获得完全的保护力，且可在不同地区使用。钩端
18、螺旋体二价及五价活疫苗、口蹄疫A、O型鼠化弱毒疫苗等。,混合疫苗（mixed vaccine）：又称多联疫苗，指利用不同微生物增殖培养物，按免疫学原理和方法组合而成。接种动物后，能产生对相应疾病的免疫保护，具有减少接种次数和使用方便等优点，是一针防多病的生物制剂。,按疫苗病原菌（毒）株的来源，疫苗又有同源疫苗和异源疫苗之分,同源疫苗（homologous vaccine）：指利用同种、同型或同源微生物株制备的，而又应用于同种类动物免疫预防的疫苗。异源疫苗（heterlogous vaccine）：用不同种微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中不含有病原体产生抵抗力。如犬在接种麻疹疫苗后，能产生对犬瘟热的抵抗力。用同一种中一种型（生物型或动物源型）微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原体的抵抗力。如接种猪型布鲁氏菌弱毒菌苗后，能使牛获得对牛型和使羊获得对羊型以及使绵羊获得对绵羊型布氏鲁菌病的免疫力。,
