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1、第五章 新型的萃取分离技术,胶团萃取双水相萃取超临界流体萃取固相(微)萃取、液相微萃取微波辅助溶剂萃取加速溶剂萃取溶剂徽胶囊萃取,超临界流体萃取 Supercritical F1uid Extraction,一、概述二、超临界流体萃取原理 三、SFE萃取的基本流程四、SFE萃取的特点五、应用,一、概述,超临界流体萃取(Supercritical F1uid Extraction,SFE)，也叫气体萃取(Gas Extraction)、流体萃取(F1uid Extraction)、稠密气体萃取(Dense Gas Extraction)或蒸馏萃取(Destraction).由于萃取中的一个重要因
2、素是压力，有效的溶剂萃取过程也可以在非临界状态下实现，因此广义地称之为压力流体萃取(Pressure Fluid Extraction),它是利用超临界流体(Supercritical Fluid，SCF)，即温度和压力略超过或靠近超临界温度(Tc)和临界压力(pc)、介于气体和液体之间的流体，作为萃取剂，从固体或液体中萃取出某种高沸点或热敏性成分，以达到分离和纯化的目的。,超临界流体萃取作为一种分离过程的开发和应用，是基于在超临界状态下溶剂对固体和液体的萃取能力和选择性，比在常温常压条件下可获得极大的提高。,作为一个分离过程，超临界流体萃取介于蒸馏和液液萃取过程之间。蒸馏是物质在流动的气体中
3、，利用不同的蒸气压进行蒸发分离；液液萃取是利用溶质在不同的溶液中溶解能力的差异进行分离；超临界流体萃取是利用临界或超临界状态的流体，依靠被萃取的物质在不同的蒸气压力下所具有的不同化学亲和力和溶解能力进行分离、纯化的单元操作，即此过程同时利用了蒸馏和萃取现象蒸气压和相分离均在起作用。,超临界流体技术自上世纪70年代开始崭露头角，随后便以其环保、高效等显著优势轻松超越传统技术，迅速渗透到萃取分离、石油化工、化学反应工程、材料科学、生物技术、环境工程等诸多领域，并成为这些领域发展的主导之一。超临界萃取特别适用于食品和医药工业。在美国和欧洲，年生产能力上万吨的茶叶处理和脱咖啡因工厂早已投入生产，啤酒花
4、有效成分、香料等的萃取在不少国家已达到产业化规模。超临界萃取技术在药物、保健品提取等方面的研究和应用也取得了较大进展，美国科学家已开始用超临界CO2从植物中提取抗癌药物，从油子中提取保健品。,超临界萃取技术在其它方面也有着广泛的应用前景。如金属与适当配位体生成络合物后，可以溶解于超临界CO2。利用这一性质，可以将一些金属直接从固体和液体中提取出来，不需任何前处理过程，为金属的提取和分离提供了新的途径。同时，人们还可以借助超临界萃取技术，根据聚合物分子量、结构和化学组成对聚合物混合物进行分离。今后，随着人们对于超临界流体技术认识和研究的进一步深化，这一新兴技术必将得以更广泛和深入的应用。而超临界
5、流体技术本身也必将对人类科技进步和经济发展产生深远的影响。,要充分利用超临界流体的独特性质，必须了解纯溶剂及其和溶质的混合物在超临界条件下的相平衡行为。现用超临界纯溶剂的相图来表明临界点及其相平衡行为。下图为以纯二氧化碳的密度为第三参数的压力温度图。,1.纯溶剂的行为,二、超临界流体萃取原理,超临界流体:处于临界温度和临界压力之上的物质状态。临界温度Tc:是通过增加压力使气体变为液体的最高温度；临界压力Pc:是通过增加温度使液体变为气体的最高压力。,超临界萃取的实际操作范围以及通过调节压力或温度改变溶剂密度从而改变溶剂萃取能力的操作条件，可以用二氧化碳的对比压力对比密度图加以说明.超临界萃取和
6、超临界色谱的实际操作区域为图中黄色区域，在这一区域里，超临界流体具有极大的可压缩性。溶剂密度可从气体般的密度(0.1)递增至液体般的密度(2.0)。由图可见，等温线在一定密度范围内趋于平坦，即在此区域内微小的压力变化将大大改变超临界流体的密度.另一方面，在压力一定的情况下，提高温度可以大大降低溶剂的密度。如压力在10.3MPa时，温度从37 提高到92 也可以使密度作相应的降低，从而降低其萃取能力，使之与萃取物分离。,超临界流体萃取正是利用了这个特性，形成了新的分离工艺。它是经典萃取工艺的延伸和扩展。,流体在临界区附近，压力和温度的微小变化，会引起流体的密度大幅度变化，而溶质在超临界流体中的溶
7、解度大致上和流体的密度成正比。,当气体处于超临界状态时,成为性质介于液体和气体之间的单一相态,具有和液体相近的密度,粘度虽高于气体但明显低于液体,扩散系数为液体的10100倍;因此对物料有较好的渗透性和较强的溶解能力,能够将物料中某些成分提取出来。,超临界流体萃取分离过程就是利用超临界流体的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和温度对超临界流体溶解能力的影响而进行的。,在超临界状态下，将超临界流体与待分离的物质接触，使其有选择性地依次把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分萃取出来。并且超临界流体的密度和介电常数随着密闭体系压力的增加而增加,极性增大,利用程序升压可将不同极性的成分进行分步提取。当
8、然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以通过控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则自动完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的，并将萃取分离两过程合为一体，这就是超临界流体萃取分离的基本原理。,超临界流体是处在高于其临界点的温度和压力条件下的流体，用它作为萃取剂时，常表现出十几倍、甚至几十倍于通常条件下流体的萃取能力和良好的选择性。除此以外，它所具有的某些传递性质，也使之成为理想的萃取溶剂。,2.超临界流体的性质,不同流体状态时的物理性质,SFE就是利用了SFs独特的物理化学性能，使其较好地渗透到样品基体中，通过分配、扩散等作
9、用，基体中被分离组份在SFs中充分溶解，从而达到萃取的目的。,超临界流体的溶解性溶质在一种溶剂中的溶解度取决于两种分子之间的作用力，这种溶剂溶质之间的相互作用随着分子的靠近而强烈地增加，也就是随着流体相密度的增加而强烈的增加。物质在超临界流体中的溶解度C与超临界流体的密度之间的关系可以用下式表示：lnC=mln+b m和b值与萃取剂及溶质的化学性质有关。选用的超临界流体与被萃取物质的化学性质越相似，溶解能力就越大。在SFE中，压力和温度影响SFs的密度，进而影响SFs溶剂化能力，所以影响SFs效率。,超临界流体显示出在传递性质上的独特性，产生了异常的质量传递性能。如前所述，溶剂的密度对于溶解度
10、而言是一个非常重要的性质。但是，作为传递性质，必须对热和质量传递提供推动力。,超临界流体的传递性,粘度、热传导性和质量扩散度等都对超临界流体特性有很大的影响。超临界流体的密度近似于液相的密度，溶解能力也基本上相同。此外，传递性质值的范围在气体和液体之间，例如在超临界流体中的扩散系数比在液相中要高出l0100倍，但是黏度就比其小10l00倍，这就是说超临界流体是一种低黏度、高扩散系数易流动的相，所以能又快又深地渗透到包含有被萃取物质的固相中去，使扩散传递更加容易并能减少泵送所需的能量。同时，超临界流体能溶于液相，从而降低了与之相平衡的液相粘度和表面张力，并且提高了平衡液相的扩散系数，有利于传质。
11、超临界流体的热传导性大大超过了浓缩气体的热传导性，与液体基本上在同一数量级。这种性能在对流热传递过程中和热与质量传递过程同时发生的情况下有一个比较强的效应。,超临界流体萃取过程能否有效地分离产物或除去杂质，关键是超临界流体萃取中使用的流体必须具有良好的选择性。提高溶剂选择性的基本原则是：操作温度应和超临界流体的临界温度相接近；超临界流体的化学性质应和待分离溶质的化学性质相接近。若两条原则基本符合，效果就较理想，若符合程度降低，效果就会递减。,3.超临界流体的选择,超临界流体的选择是超临界流体萃取的主要关键。应按照分离对象与目的不同，选定超临界流体萃取中使用的溶剂，它可以分为非极性和极性溶剂两类
12、。下表给出了一些常用超临界萃取剂的临界温度和临界压力，表中最后几种萃取剂为极性剂，由于极性和氢健的缘故，它们具有较高的临界温度和临界压力。,1、萃取剂需具有化学稳定性，对设备没有腐蚀性;2、临界温度不能太低或太高，最好在室温附近或操作温度附近；3、操作温度应低于被萃取溶质的分解温度或变质温度；4、临界压力不能太高，可节约压缩动力费；5、选择性要好，容易得到高纯度制品：6、溶解度要高，可以减少溶剂的循环量；7、萃取溶剂要容易获取，价格要便宜。,超临界流体必须具备的条件,二氧化碳是超临界流体技术中最常用的溶剂，有许多优点：CO2临界温度为31.1，临界压力为7.2MPa，临界条件容易达到。适合于萃
13、取热不稳定的化合物。CO2化学性质不活波，无色无味无毒，安全性好。价格便宜，纯度高，容易获得。但是，由于CO2是非极性的流体，只适合于萃取低极性和非极性的化合物。对于极性较大的化合物，常须用极性较大的流体(如NH3、N2O等)，因为它们具有一定极性，对极性组分溶解性能好。但是SF-NH3化学活性较高，易腐蚀泵封口，而N2O有毒且易爆，另外低烃类物质因可燃易爆，也不如CO2那样使用广泛。,若采用CO2萃取极性物质，就需将其改性，常用改性方法有两种：流体改性：向CO2中加入少量极性溶剂(改性剂)，增加混合流体的极性。基体改性：直接将改性剂加到样品基体中。当被萃取物与样品基体较强地结合在一起时，这种
14、方法更为有效。,CO2 改性方法：,改善SF溶剂性能，提高低挥发溶质在超临界流体中的溶解度。改变超临界流体的PVT特性，大致可用下式表示：Tc=XaTa+XbTb Pc=XaPa十XbPb 式中，Tc、Pc分别为混合流体的临界温度和临界压力；Xa、Xb分别为溶剂A、B的摩尔分数；Ta、Tb和Pa、Pb分别为A、B的临界温度和临界压力。提高萃取混合物时对溶质的选择性,上述两种方法中改性剂的作用可归纳为三个方面：,影响超临界CO2萃取的主要因素,物料颗粒的大小（2060目）萃取压力的影响萃取温度的影响CO2流量夹带剂的选择传质性能的改善萃取时间,该流程包括如下几部分：1.高压泵。2.萃取池。3.限
15、流器（阻尼器）4.收集器。5.控制部分。,三、SFE萃取的基本流程,（1）高压泵 高压泵的作用是对超临界流体（包括改性剂）加压并将其传送至萃取池，常用高压注射泵。加压系统具有程序升压和程序升密功能。（2）萃取池萃取池是超临界流体萃取进行的主要场所，其作用是盛放样品。液体样品通常是从萃取池底部引入，出口在上方，呈逆流形式，使超临界流体和分析物充分接触，提高萃取的效率。（3）阻尼器阻尼器也称节流器，其作用是限制超临界流体流出萃取池流人收集器的流量和压力。高压针阀阻尼器其特点是流量限制可以调节。但是价格较贵，同时不能像毛细管那样经常更换，容易出现交叉污染的情况。,（4）收集器 收集器也称采集器或吸收
16、池，其作用是收集萃取的目标分析物。收集器种类繁多，一般容器都可以使用。分析物随超临界流体流出萃取池后，必须采用适当的方法使大量的超临界流体与分析物分离，从而得到纯品。目前，通用的方法有两种：升温法和降压法。在压力不变的情况下，可以让承载有分析物的超临界流体流经热交换器进行升温，超临界流体中的溶质因密度降低而析出，此法为升温法。若温度不变，可以使超临界流体流经阻尼器，在阻尼器的出口是常压，超临界流体因降压密度变小而析出溶质，此法为降压法。降压法较升温法常用，但是分析物因压力降低而膨胀会形成气溶胶，堵塞阻尼器，解决的办法是采用密封收集或者使用大口阻尼器。（5）控制部分用微机控制温度系统和高压泵系统
17、，进行恒温和程序升温、恒压或程序升压、恒密或程序升密以及程序修改等操作。目前微机技术的发展，为超临界流体萃取与其他分析技术的联用提供了很好的软件平台，操作者也更容易在良好的操作界面下优化和使用超临界流体。,SFC 流程示意图,可分为动态、静态、静态动态三种。1.动态萃取：它简单、方便、快速，特别适合于萃取那些在超临界流体萃取剂中溶解度很大的物质，而且样品基体又很容易被SFs渗透的场合。该法SFs用量大。2.静态萃取：适合萃取与基体较难分离和在流体中溶解度不大的溶质，也适合于样品基体较为致密，SFs不易渗透的样品。3.静态动态萃取：即静态与动态法的结合。该法比静态法效率高，而且可以克服动态法的缺
18、点，适用于那些动态法萃取效率不高的样品。,操作方式：,1萃取和分离合二为一，当饱含溶解物的二氧化碳超临界流体流经分离器时，由于压力下降使得CO2与萃取物迅速成为两相（气液分离）而立即分开，不存在物料的相变过程，不需回收溶剂,操作方便；不仅萃取效率高，而且能耗较少，节约成本。2压力和温度都可以成为调节萃取过程的参数。临界点附近，温度压力的微小变化，都会引起CO2密度显著变化，从而引起待萃物的溶解度发生变化，可通过控制温度或压力的方法达到萃取目的。压力固定，改变温度可将物质分离；反之温度固定，降低压力使萃取物分离；因此工艺流程短、耗时少。对环境无污染，萃取流体可循环使用，真正实现生产过程绿色化。,
19、四、SFE萃取的特点,3萃取温度低,CO2的临界温度为31.265,临界压力为 7.18MPa,可以有效地防止热敏性成分的氧化和逸散，完整保留生物活性，而且能把高沸点，低挥发渡、易热解的物质在其沸点温度以下萃取出来。4.临界CO2流体常态下是气体,无毒,与萃取成分分离后,完全没有溶剂的残留,有效地避免了传统提取条件下溶剂毒性的残留。同时也防止了提取过程对人体的毒害和对环境的污染,100%的纯天然。5超临界流体的极性可以改变,一定温度条件下,只要改变压力或加入适宜的改性剂即可提取不同极性的物质,可选择范围广。,超临界流体萃取由于高效、快速、后处理简单等特点，是一种很理想的样品前处理“清洗”技术，
20、在近年来得到了广泛的应用。具体应用可以分为以下几个方面：1、从药用植物中萃取生物活性分子，生物碱萃取和分离；2、来自不同微生物的类脂脂类，或用于类脂脂类回收，或从蛋白质中去除类脂脂类；3、从多种植物中萃取抗癌物质，特别是从红豆杉树皮和枝叶中获得紫杉醇防治癌症；4、维生素，主要是维生素E的萃取；5、对各种活性物质（天然的或合成的）进行提纯，除去不需要分子（比如从蔬菜提取物中除掉杀虫剂）或“渣物”以获得提纯产品；6、对各种天然抗菌或抗氧化萃取物的加工，如罗勒、串红、百里香、蒜、洋葱、春黄菊、辣椒粉、甘草和茴香子等。,五、SFE的应用,传统的食用油提取方法是乙烷萃取法，但此法生产的食用油所含溶剂的量
21、难以满足食品管理法的规定，美国采用超临界二氧化碳萃取法提取豆油获得成功，产品质量大幅度提高，且无污染问题。目前，已经可以用超临界二氧化碳从葵花籽、红花籽、花生、小麦胚芽、棕榈、可可豆中提取油脂，且提出的油脂中含中性脂质，磷含量低，着色度低，无臭味。这种方法比传统的压榨法的回收率高，而且不存在溶剂法的溶剂分离问题。专家们认为这种方法可以使油脂提取工艺发生革命性的改进。,例1.在食品方面的应用,在抗生素药品生产中，传统方法常使用丙酮、甲醇等有机溶剂，但要将溶剂完全除去，又不使药物变质非常困难，若采用SCFE法则完全可以符合要求。美国ADL公司从7种植物中萃取出了治疗癌症的有效成分，使其真正应用于临
22、床。用SCFE法从银杏叶中提取的银杏黄酮，从鱼的内脏，骨头等提取的多烯不饱和脂肪酸（DHA，EPA），从沙棘籽提取的沙棘油，从蛋黄中提取的卵磷脂等对心脑血管疾病具有独特的疗效。日本学者宫地洋等从药用植物蛇床子、桑白皮、甘草根、紫草、红花、月见草中提取了有效成分。,例2.在医药保健品方面的应用,用SCFE法萃取香料不仅可以有效地提取芳香组分，而且还可以提高产品纯度，能保持其天然香味，如从桂花、茉莉花、菊花、梅花、米兰花、玫瑰花中提取花香精，从胡椒、肉桂、薄荷提取香辛料，从芹菜籽、生姜，莞荽籽、茴香、砂仁、八角、孜然等原料中提取精油，不仅可以用作调味香料，而且一些精油还具有较高的药用价值。啤酒花是
23、啤酒酿造中不可缺少的添加物，具有独特的香气、清爽度和苦味。传统方法生产的啤酒花浸膏不含或仅含少量的香精油，破坏了啤酒的风味，而且残存的有机溶剂对人体有害。超临界萃取技术为酒花浸膏的生产开辟了广阔的前景。美国SKW公司从啤酒花中萃取啤酒花油,已形成生产规模。,例3.天然香精香料的提取,近年来的研究发现超临界条件下的酶催化反应可用于某些化合物的合成和拆分。另外在超临界或亚临界条件下的水可作为一种酸催化剂，对纤维素的转化起催化作用，使其迅速转化为葡萄糖。1988年开发了超临界流体细胞破碎技术（CFD）。用超临界CO2作介质，高压CO2易于渗透到细胞内，突然降压，细胞内因胞内外较大的压差而急剧膨胀发生
24、破裂。超临界流体还被用于物质结晶和超细颗粒的制备当中。,例4.生物工程方面的应用,近10多年来，我国超临界流体技术研究和应用，从基础数据、工艺流程及实验设备等方面均有较好的发展，已形成了一支由科研单位、高等院校和企业构成的高素质研究、开发、应用队伍，并取得了一批我国的自主专利技术，尤其在中药现代化应用方面颇具特色和前景。中科院地化所超临界流体技术研究开发中心在超临界流体萃取设备的研制和生物资源有效成分的提取及产品开发等方面，取得了多项重要成果。,国内研究现状,但目前我国的超临界流体萃取技术的研究和应用状况不容乐观，主要表现在重复性研究多于实际应用，小规模试验多于大规模生产，设备制造商的经济收益
25、大于设备使用企业的经济收益。原因:一是设备操作压力高，造价高，产品成本高，企业一次性投资风险大；二是超临界二氧化碳萃取性能的普遍适用性不高，它主要适用于非极性或弱极性化合物的提取，如油脂、挥发油等；三是目前国内所用的设备均属于简单萃取，而简单萃取方法无法生产高纯度产品，因而大部分产品附加值不高；四是不少企业对该技术及装备情况知之甚少，对其所生产产品的市场情况调查不够，在应用该技术及购置装备时存在较大盲目性。,江苏南通华安SFE有限公司,HA420-40-96-EX型,第七章 双水相萃取技术（ATPE）,aqueous two-phase extraction,一、双水相萃取的起源,双水相萃取(
26、Aques two phase extration,ATPE)技术始于20世纪60年代,瑞典伦德大学的Albertson理首先研究双水相技术,他主要研究了聚乙二醇/葡聚糖(PEG/DEX)系统和PEG/盐系统在分离纯化中的应用。在随后的几十年中,这项技术有了长足的发展。在双水相的分离模型研究中,主要提出了两类模型:Edmond等人提出的渗透维里模型,即Edmond-Ogston方程,在预测聚合物的成相行为和蛋白质的分配上有较高的准确度 Flory和Huggins根据热力学的基本原理提出晶格模型,在粒子的能量概念上可以很好地拟合实验数据.,1979年德国的Kula等人将双水相萃取分离技术应用于生
27、物产品分离.在1896年Beijerinck观察到当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉的水溶液混合时,就得到一个浑浊不透明的溶液,它随之分成两个液相,这就是后期的双水相体系。虽然只有20多年的历史,但由于其条件温和,容易放大,可连续操作,目前,双水相技术几乎在所有的生物物质的分离纯化中得到应用:如氨基酸、多肽、核酸、细胞器、细胞膜、各类细胞、病毒等,特别是成功地应用在蛋白质的大规模分离中,同时也已被成功的应用到生物转化及生物分析中。国内自20世纪80年代起也开展了双水相萃取技术研究。,二、双水相萃取技术的原理,1、双水相的形成 将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混合时,当聚合物浓度达到一定值,体系会自
28、然的分成互不相溶的两相,这就是双水相体系。双水相体系的形成主要是由于高聚物之间的不相溶性,即高聚物分子的空间阻碍作用,相互无法渗透,不能形成均一相,从而具有分离倾向,在一定条件下即可分为二相。一般认为只要两聚合物水溶液的憎水程度有所差异,混合时就可发生相分离,且憎水程度相差越大,相分离的倾向也就越大。或者说双水相是利用物质在互不相溶的两水相间分配系数的差异来进行的萃取。,不同的高分子溶液相互混合可产生两相或多相系统。如葡聚糖与聚乙二醇按一定比例与水混合，溶液混浊，静置平衡后，分成互不相溶的两相，上相富含PEG，下相富含葡聚糖，如图所示,如等量的1.1%右旋糖酐溶液和 0.36%甲基纤维素溶液混
29、合，静止后产生2 相，上相含右旋糖酐0.39%，含甲基纤维素0.65%；而下相含右旋糖酐1.58%，含甲基纤维素0.15%。一般情况下，两种高聚物水溶液相互混合时，它们之间的作用可以分为三类：1、互不相溶（incompatibility），两种高聚物产生相互斥力，形成两个水相，两个高聚物分别富集于上下两相。2、复合凝集（complex coacervation），两种高聚物产生相互引力而聚集于同一相，也形成两个水相，但两种高聚物都分配于一相，另一相几乎全部为溶剂水。3、完全互溶（complete misciblity）,形成均相的高聚物水溶液。,2、常用双水相系统,表1列出了近几年研究较多的双
30、水相系统,常用于物质分离的双水相体系高聚物体系:聚乙二醇(简称PEG)/葡聚糖(简称Dextran)和PEG/Dextran硫酸盐体系。高聚物与低相对分子质量化合物之间形成的双水相系统，如聚乙二醇与硫酸胺或硫酸镁溶液。近几年也开发了一些高聚物与低分子量的某些表面活性剂之间，以及很多普通有机物和无机盐之间的双水相体系。,两种高聚物之间形成的双水相系统并不一定是液相，其中一相可以或多或少地成固体或凝胶状，如PEG的相对分子质量小于1000时，葡聚糖可形成固态凝胶相。多种互不相溶的高聚物水溶液按一定比例混合时，还可形成多相系统。,双水相体系萃取分离原理是基于生物物质在双水相体系中的选择性分配。当生物
31、物质进入双水相体系后，在上相和下相间进行选择性分配，这种分配关系与常规的萃取分配关系相比，表现出更大或更小的分配系数。溶质在两不相间的分配主要由其表面性质所决定，而分配能力的大小则用分配系数K来表示。分配系数K其分配规律服从Nernst 分配定律，即 K=t/b(1)式中Ct，b分别代表上相、下相中的被萃取物（分子或粒子）的浓度，mol/L。研究表明，在相体系固定时，预分离物质在相当大的浓度范围内，分配系数 为常数，与溶质的浓度等无关，只取决于被分离物质本身的表面性质、温度和特定的双水相体系的性质。,3、分配系数K及相关理论计算,在双水相萃取系统中，悬浮粒子与其周围物质具有复杂的相互作用，如氢
32、键、离子键、疏水作用等，同时还包括一些其他较弱的作用力，很难预计哪一种作用占优势，但是在两水相之间，净作用力一般会存在差异。将一种粒子从相2移到相1所需的能量如为E，则当系统达到平衡时，根据 相平衡时化学位相等的原则，从rounstedt 方程式求得分配系数 即C1/C2=eE/kT（2）式中 k 波尔兹曼常数 T 绝对温度 C1溶质在相1中的浓度，mol/L C2溶质在相2中的浓度，mol/L,显然，E与被分配粒子的大小有关，粒子越大，暴露于外界的粒子数越多，与其周围相系统的作用力也越大。故E 可看作与粒子的表面积A或相对分子质量M成正比即 C1/C2=e A/kT=e M/kT（3）M-物
33、质相对分子质量 A粒子的表面积 系统的表面特性系数，表征粒子性能的参数（与表面积或分子量无关）,如果粒子所带的净电荷为Z，则在两相间存在电位差U1-U2时，E 中应包括电能项Z（U1-U2），则有 C1/C2=e 1 A+Z(U1-U2)/kT（4）式中1 与粒子大小和净电荷无关，而决定于其它性质的常数 通过公式1-4可知，分配系统由多种因素决定，如粒子大小，分子质量，温度，表面电荷及分子构象等，这些因素的微小变化均可导致分配系数较大的变化，因而双水相萃取有较好的选择性。,4、双水相系统的相图,两种高聚物的水溶液，当它们以不同的比例混合时，可形成均相或两相，可用相图来表示。当它们的组成在图1曲
34、线的右上方时(用点表示)体系就会分成两相,分别有不同的组成和密度,轻相(或称上相)组成用点表示,重相(或称下相)组成用表示。曲线称为结线,直线称为系线。结线上方是两相区,下方是单相区。组成位于M点的系统实际上由位于T，B两点的两相所组成，当系线向下移动时，长度逐渐减少，这表明两相的差别减小，当达到点时，系线的长度为零，两相间的差别消失，所以称C点为临界点。,假设系统总量为m0，高聚物Dextran在上、下相的含量分别为mt，mb则 mt+mb=m0(5)100 mt=VttCt(6)式中Vt 上相体积 t 上相密度 Ct 葡聚糖在上相的浓度 对于下相同样有 100 mb=VbbCb(7),设C
35、0为葡聚糖在系统中的总浓度，则由物料衡算可得：100 m0=(Vtt+Vbb)C0(8)将公式6，7，8代入式5得：Vtt/Vb b=Cb-C0/C0-Ct(9)由图1得：Cb-C0/C0-Ct=MB/MT（10）将公式10代入9得：Vtt/Vb b=MB/MT（11）双水相系统含水量高，上、下相密度与水接近，因此，如果忽略上、下相的密度差，则由式11可知，相体积比可用系线上MB与MT的距离之比来表示。,3影响双水相萃取的因素,物质在双水相体系中的分配系数不是一个确定的量,它要受许多因素的影响(表1)。对于某一物质,只要选择合适的双水相体系,控制一定的条件,就可以得到合适的(较大的)分配系数,
36、从而达到分离纯化之目的。,这里以PEG/Dextran双水相系统为例，说明影响双水相萃取的主要因素3.1成相高聚物浓度-界面张力 一般来说，双水相萃取时，如果相系统组成位于临界点附近，则蛋白质等大分子的分配系数接近于1，高聚物浓度增加，系统组成偏离临界点，蛋白质的分配系数也偏离1，即K1或K1，但也有例外情况，高聚物浓度增加，分配系数先增大，达到最大值后便逐渐降低，这说明，在上、下两相中，两种高聚物的浓度对被分离物质分配系数有不同的影响。对于位于临界点附近的相系统，目的物可完全分配于上相或下相，此时不存在界面吸附。但当高聚物浓度增大，界面吸附增强，两相界面张力也相应增大。,3.2 成相高聚物的
37、相对分子质量,对于给定的相系统，如果一种高聚物被低相对分子质量的同种高聚物所代替，被萃取的大分子物质，如蛋白质，核酸，细胞粒子等，将有利于在低相对分子质量高聚物一侧分配。如在PEG-Dextran系统中，PEG相对分子质量降低或Dextran相对分子质量增大，蛋白质分配系数将增大。当成相高聚物浓度，盐浓度，温度等其他条件不变时，被分配的蛋白质易为相系统中低相对分子质量高聚物所吸引，而被高相对分子质量的高聚物所排斥。但对于小分子物质，如氨基酸，小分子蛋白，它们的分配系数受高聚物相对分子质量的影响并不象大分子那样显著。基于以上原则，在选择相系统时，可改变成相高聚物的相对分子质量以获得所需分配系数，
38、特别是当所采用的相系统离子组分必须恒定时，改变高聚物相对分子质量更加适用，来获得较好的分离效果。,3.3电化学分配,双水相萃取时，盐对带电大分子的分配影响很大。生物大分子的分配主要决定于离子的种类和各种离子之间的比例，而离子强度在此显得并不重要，这主要是由于离子在上下相不均等形成的电位差。表2例举了各种无机盐在PEG-Dextran双水相系统中的分配情况。,由上表可以看出，各种盐的分配系数存在着微小的差异，正是这种微小的不均等分配产生了相间电位。在双水相聚合物系统中,加入电解质时,其阴阳离子在两相间会有不同的分配。同时,由于电中性的约束,存在一穿过相界面的电位差,它是影响荷电大分子如蛋白质和核
39、酸等分配的主要因素。同样,对于粒子迁移也有相似的影响,粒子因迁移而在界面上积累。故只要设法改变界面电位,就能控制蛋白质等电荷大分子转入某一相。如某种盐，所带电荷为Z+和 Z-，界面电位差U2-U1可用下式表示 U2-U1=RT/（Z+Z-）F lnK-/K+(12)R：气体常数；F：法拉第常数；T：绝对温度 K+、K-，没有相间电位存在时正负离子的分配系数由式12可知，K-/K+越大，界面电位越大。即该盐解离出来的两种离子，在两相间的亲和力差别越大，界面电位差越大。,3.4 疏水反应,选择适当的盐组成，相系统的电位差可消失。排除了电化学效应后，决定分配系数的主要因素可能即为粒子的表面疏水性了。
40、在成相高聚物的末端偶联上疏水性基团后，疏水效应会更加明显。水溶液中聚合物的疏水性按下列次序递增:葡萄糖硫酸盐甲基葡萄糖葡萄糖羟丙基葡聚糖甲基纤维素聚乙烯醇聚乙二醇聚丙三醇。这种疏水性的差异对目的产物与相的相互作用是重要的。同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加,其大小的选择依赖于萃取过程的目的和方向,若想在上相获得较高的蛋白质收率,对于PEG聚合物,应降低它的平均分子量,相反,若想在下相获得较高的蛋白质收率,则平均分子量应增加。,3.5 生物亲和分配 成相高聚物偶联生物亲和配基后，它对生物大分子的分配系数影响很显著。如在PEG上共价结合一个与蛋白质有亲和力的配基后，设它的分配系数为KL-PEG为
41、，蛋白质分配系数为KP，蛋白质、配基和PEG复合物的分配系数为KP-L-PEG，它在上下相的离解常数分别为K1、K2，则有下式：KP-L-PEG=KP KL-PEG K2/K1（13）如果蛋白质含N个独立的连接位点，则 KP-L-PEG=KP（KL-PEG K2/K1）N（14）如果复合物在上下相的离解能力相同（K1=K2），KP-L-PEG=KP（KL-PEG）N（15）lgKP-L-PEG=lgKP+NlgKL-PEG（16）由以上公式可知，对每一个结合位点，蛋白质分配系数可增加10-100倍，如果蛋白质含有几个结合位点则分配系数可增加几个数量级，实验证实，当PEG与亲和配基连接后，分配系
42、数一般增大10-10000倍。,3.6pH值的影响 体系的pH值对被萃取物的分配有很大影响,这是由于体系的pH值变化能明显的改变两相的电位差。如体系pH值与蛋白质的等电点相差越大,则蛋白质在两相中分配越不均匀。,3.7温度的影响 温度在双水相分配中是一个重要的参数。但是，温度的影响是间接的，它主要影响高聚物的组成，只有当相系统组成位于临界点附近时，温度对分配系数才有较敏感的作用。一般情况下，双水相对温度的变化不敏感,这是由于成相聚合物对蛋白质有稳定化作用,所以室温操作活性收率依然很高,而且室温时粘度较冷却时(4)低,有助于相的分离并节省了能源开支。,三、双水相萃取技术优点,1.系统含水量多达7
43、5%90%,两相界面张力极低，有助于保持生物活性和强化相互间的质量传递,双水相体系的相间张力大大低于有机溶剂与水相之间的相间张力，相分离条件温和，因而会保持绝大部分生物分子的活性，而且可直接用在发酵液中。如潘杰等人用双水相技术直接从发酵液中将丙酰螺旋酶素与菌体分离、纯化；2.分相时间短(特别是聚合物/盐系统),自然分相时间一般只有515min。双水相系统之间的传质和平衡过程速度快，回收效率高，相对于某些分离过程来说，能耗较小，速度快。如选择适当体系，回收率可达 以上，提纯倍数可达 倍；,3.双水相分配技术易于连续化操作。设备简单，且可直接与后续提纯工序相连接，无需进行特殊处理；.大量杂质能够与
44、所有固体物质一起去掉,与其它常用固液分离方法相比,双水相分配技术可省去12个分离步骤,使整个分离过程更经济。且操作条件温和，整个操作过程在常温常压 下进行；.设备投资费用少,操作简单,不存在有机溶 剂残留问题，高聚物一般是不挥发性物质，因而操作环境对人体无害。,.易于放大，各种参数可以按比例放大而产物收率并不降低。有放大实验证明分离效果除分配系数外仅与分离体积有关，这是其他过程无法比拟的，这一点对于工业应用尤为有利。如分配系数分别为K1和K2的两种物质，以G表示被萃取物质在上、下相的含量之比 G=CtVt/CbVb(17)G=KVt/Vb（18）由公式18可知，除分配系数K以外，相体积比影响物
45、质的分离效果。,7.对分离物质进行了浓缩 利用双水相分配对萃取物质进行浓缩过程见下图。初始体积为V0，萃取物浓度为C0，加入两种成相高聚物溶液，其总量为V，经混和分相后，产物集中于下相，其体积为Vb,则上相体积 Vt=V0+V-Vb（19）VtCt+VbCb=VoC0(20)产物浓缩效果以浓缩因子表示，=Cb/C0（21）由式20，21可得=V0/Vb（1+VtK/Vb)(22)其中K为分配系数，值越大，浓缩效果越好。浓缩收率y为 y=100CbVb/C0V0(23)y=100Vb/V0(24)Y=100/1+VtK/Vb(25)由（22）和（25）可知，当相体积比Vt/Vb保持不变时，产物的
46、分配系数K减小，浓缩因子和浓缩收率都增大。但是当K，V0和V一定，Vb减小，则收率y也减小，而浓缩因子却增大，所以，选择Vb值时，必须取折中值。,8、双水相和传统工艺分离效果的比较 在传统发酵中，细胞碎片的去除是分离纯化的第一步，离心法耗能太大，而过滤法则存在膜孔易堵塞问题，有实验对三种方法进行了比对。,四、双水相萃取的工艺流程,双水相萃取技术的工艺流程主要由三部分构成:目的产物的萃取;的循环;无机盐的循环。另外，现在也实现了胞内酶的连续萃取。,目的产物的萃取原料匀浆液与PEG和无机盐在萃取器中混合,然后进入分离器分相。通过选择合适的双水相组成,一般使目标物分配到上相(PEG相),而细胞碎片、
47、核酸、多糖和杂蛋白等分配到下相(富盐相)。第二步萃取是将目标物转入富盐相,方法是在上相中加入盐,形成新的双水相体系,从而将目标物与PEG分离,以利于使用超滤或透析将PEG回收利用和目的产物进一步加工处理。PEG的循环在大规模双水相萃取过程中,成相材料的回收和循环使用,不仅可以减少废水处理的费用,还可以节约化学试剂,降低成本。PEG的回收有两种方法:加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收;将相通过离子交换树脂,用洗脱剂先洗去,再洗出蛋白质。无机盐的循环将含无机盐相冷却,结晶,然后用离心机分离收集。除此之外还有电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。,五、双水相萃取技术的应用,1.分离和提纯各种
48、蛋白质(酶)用/(4)24双水相体系,经一次萃取从-淀粉酶发酵液中分离提取-淀粉酶和蛋白酶,萃取最适宜条件为1000(15%)-(4)24(20%),=8,-淀粉酶收率为90%,分配系数为19.6,蛋白酶的分离系数高达15.1。比活率为原发酵液的1.5倍,蛋白酶在水相中的收率高于60%。通过向萃取相(上相)中加入适当浓度的(4)24可达到反萃取。实验结果表明,随着(4)24浓度的增加,双水相体系两相间固体物质析出量也增加。固体沉淀物即可干燥后生产工业级酶制剂,也可将固体物加水溶解后用有机溶剂沉淀法制造食品级酶制剂。,Harris用双水相体系从牛奶中纯化蛋白,研究了牛血清蛋白()、牛酪蛋白、-乳
49、球蛋白在/磷酸盐体系中的分配以及相对分子质量、值和盐的加入对三种蛋白分配的影响，实验结果表明，增加NaCI浓度可提高分配系数,最佳值为5。对和牛酪蛋白,可得到更高的分配系数。在含有疏水基葡聚糖中,蛋白质和类囊体薄膜泡囊的分配研究表明,苯甲酰基葡聚糖和戊酰基葡聚糖具有疏水性。淀粉、纤维素等高聚物具有光学活性，它们应该可以辨别分子的D，L型。对映体分子在上述高聚物相系统中具有不同的分配特点。一种蛋白质对D或L型能选择性地结合而富集于一相中，可将此用于手性分配。如，在含血清白蛋白的相系统中，D、L型色氨酸可获得分离。,2.提取抗生素和分离生物粒子 用双水相技术直接从发酵液中将丙酰螺旋霉素与菌体分离后
50、进行提取,可实现全发酵液萃取操作。采用PEG/Na2HPO4体系,最佳萃取条件是=8.08.5,PEG-2000(14%)/Na2HPO4(18%),小试收率达69.2%,对照的乙酸丁酯萃取工艺的收率为53.4%,PEG不同相对分子质量对双水相提取丙酰螺旋霉素的影响不同,适当选择小的相对分子质量的PEG有利于减小高聚物分子间的排斥作用,并能降低体系粘度,有利于抗生素分离。采用双水相技术,可直接处理发酵液,且基本消除乳化现象,在一定程度上提高了萃取收率,加快了实验进程,但引起纯度下降,需要进一步研究和改进。,3.天然产物的分离与提取 双水相萃取技术可用于许多中药等天然产物的分离纯化,效果明显。霍
