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1、1,采样、HA、HI、洗血、配制培养液等步骤,2,洗血,1ml 肝素可以抗凝 5.5ml血液,心脏抽取豚鼠血液2ml,在离心管里面加PBS至10ml,离心 3000rpm/5min,用塑料吸管弃上清，再加PBS至10ml,离心 1,3,离心 2,离心 3000rpm/5min,弃上清，加PBS至10ml,离心 4000rpm/10min,去上清，用塑料吸管将血细胞吸入玻璃瓶,加PBS稀释到0.6%，4%保存备用,4,采样,地点：汕头大学医学院附属第一医院儿科时间：周一周五 上午9:00 11:00发烧儿童体温高达37.7以上，在7天内出现疑似病毒感染的呼吸道症状，年龄0-18岁，经就诊儿童父母
2、同意采集鼻咽拭子，采完装入采样管，放入冰包，同时做好记录。,5,采样液配制,以100ml为例：100ml MEM10ml PS1ml 制霉菌素,6,标本稀释液,100ml MEM5ml PS(青链霉素),7,病毒稀释液,100ml MEM200ul TPCK胰酶1ml PS,8,细胞培养液,100ml MEM10ml FBS1ml PS,9,种标本,STUC附属第一医院采取流感症状发热儿童咽拭子,咽拭子在振荡器上面振荡，使棉签中的标本充分溶解于液体中,用移液枪取220ul样本稀释液加入到1ml离心管中,吸取275ul标本液加入该离心管中,振荡、在室温作用1-2小时后离心：10000rpm/3m
3、in,10,用PBS将细胞培养管洗两遍,吸取420ul离心后的标本液加入细胞培养管,35吸附1-2h,加维持液后放入培养箱里，培养5d，每天观察CPE,阳性,阴性,冻存或者继续接种细胞,盲传，同时冻存,11,HA test,红细胞凝集实验,12,100ul virus,50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50,50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50,step1:add 50ul PBS in 2-12,step2:add 100ul virus in 1,step3:coubling dilution,titer:1 2 4 8 16 32 6
4、4 128 256 512 1024 2048,titer=2n-1,13,取96孔板，用记号笔做好标记,在212号排列孔里各加入50ml PBS,在1号排列里各加入100ml 病毒液,用排枪从1号孔吸取50ml，加入2号孔，反复吹吸，吸取50ml加入3号管,112号孔里面各加入50ul 火鸡血/豚鼠血,火鸡血用U型板豚鼠血用V型板,静置30min，判读,14,阳性,阴性,冻存或者继续接种细胞,盲传，同时冻存,吸取500ul 病毒液，离心:10000rpm/3min,将细胞培养管用PBS洗两遍，之后加入病毒液,35吸附1-2h,加维持液，培养5d，每天观察CPE,15,HI test,红细胞凝
5、集抑制试验,16,Adjust 4AD,Then the HA titer4,titer=2n-1,titer=4,50ml,X,X=,50ml,2n-3,X 为第一个孔里面要加的病毒量，然后加PBS至50ml,=,或者公式二,V总,Vvirus,HA,8,17,H2O:50XVirus:X,18,50ul serum,25ul PBS,25ul,add 25ul virus to every wellwait for 45minadd 50ul blood to every well,19,Cell culture,Cell culture flask:S 25cm2 5mlM 75cm2
6、1015mlL 175cm2 30mlDilution ratio/dilutionrate:Two days 1 to 810Three days 1 to 20,20,Plan,Cell culture tube 1ml96 well plate 9620ul(1980ul)If you need 200 tubes in 2 days,the plan as follow:Total need cell culture fluid:201ml20ml/10(dilutionrate for 2 days)=2ml(take 2ml from the 810ml of diluted from M flask),21,If you need 20 96-well plates in 2 days,the plan as follow:,Need total volume:209620ul=40mlCell culture flask:40ml/10=4ml(take 4ml from the 810ml of diluted from M flask),
