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1、六.真核基因在原核细胞中的表达,实验目的,了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法,实验原理,外源基因的转录模式组成型表达：表达载体的启动子为组成型启动子，也就是一直努力不停表达目的蛋白的启动子，如果表达一些对宿主细菌生长有害的蛋白。因为过量或者有害的表达产物会影响细菌的生长，反过来影响表达量的积累。诱导调控型表达：表达载体采用诱导型启动子，只有在诱导剂存在的条件下才能表达目的产物。这种方法有助于避免菌体生长前期高表达对菌体生长的影响。,实验原理,表达载体启动子乳糖操纵子抑制基因（I）+启动子（P）+操纵基因（O）+结构基因（ZYA）,lacI产物是一种阻遏蛋白，能结合在操纵基因O 上从而阻遏
2、转录起始，LacZ编码半乳糖苷酶（-galactosidase）。,实验原理,表达载体启动子 乳糖操纵子,培养基中有乳糖（lactose）时，乳糖进入细胞后，在-半乳糖苷酶催化下转化为乳糖的异构物-异乳糖（allolactose）,实验原理,表达载体启动子乳糖操纵子,IPTG是的结构类似物，异乳糖可以被-半乳糖苷酶水解成葡萄糖（glucose）和半乳糖（galactose），但是IPTG不会被水解，它可以作为诱导物，诱导基因表达。IPTG进入细胞也不需要透性酶帮助，所以调节IPTG浓度，可以调节蛋白的表达量。,实验原理,蛋白可经SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯酰胺
3、作为支持物的一种电泳形式。单体-丙烯酰胺和交联剂-甲叉双丙烯酰胺相互作用可形成聚丙烯酰胺，该聚合反应以TEMED（四乙基乙二胺）作为催化剂，以AP（过硫酸铵）作为引发剂。SDS是十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS)是一种阴离子去污剂。,实验原理,由于十二烷基硫酸根带负电，使各种蛋白质的 SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的二级和三级结构，强还原剂能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，进行电泳时，蛋白质分子的迁移速度取决于分子大小。,不连续系统：浓
4、缩胶和分离胶（胶孔径不同，胶PH不同）。蛋白质浓缩效应：在不连续电泳系统中，含有上、下槽缓冲液(TrisGly)、浓缩胶缓冲液(TrisHCl，pH6.8)、分离胶缓冲液(TrisHCl，pH8.8)，两种凝胶的浓度(即孔径)也不相同。在这种条件下，缓冲系统中的HCl 几乎全部解离成Cl，两槽中的Gly(pI6.0)只有很少部分解离成Gly 的负离子，而酸性蛋白质也可解离出负离子。这些离子在电泳时都向正极移动。C1速度最快(先导离子)，其次为蛋白质，Gly 负离子最慢(尾随离子)。由于C1很快超过蛋白离子，因此在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，该区电位梯度最高，这是在电泳过程中形成
5、的电位梯度的不连续性，导致蛋白质和Gly 离子加快移动，结果使蛋白质在进入分离胶之前，快、慢离子之间浓缩成一薄层，有利于提高电泳的分辨率。,分子筛效应：蛋白质离子进入分离胶后，条件有很大变化。由于其pH 升高(电泳进行时常超过9.0)，使Gly 解离成负离子的效应增加；同时因凝胶的浓度升高，蛋白质的泳动受到影响，迁移率急剧下降。此两项变化，使Gly 的移动超过蛋白质，上述的高电压梯度不复存在，蛋白质便在一个较均一的pH 和电压梯度环境中，按其分子的大小移动。分离胶的孔径有一定的大小，对不同相对分子质量的蛋白质来说，通过时受到的阻滞程度不同，即使净电荷相等的颗粒，也会由于这种分子筛的效应，把不同大小的蛋白质相互分开。,在不连续体系SDS-PAGE中,当分离胶加完后,需在其上加一层水,为什么?在不连续体系SDS-PAGE中,分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP,试述其作用?样品液为何在加样前需在沸水中加热几分钟?,
